Die MAVS-Signalisierung ist erforderlich, um anhaltende Chikungunya-Herzinfektionen und chronische Gefäßgewebeentzündungen zu verhindern

Nov 17, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4668 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Infektion mit dem Chikungunya-Virus (CHIKV) wurde mit schweren kardialen Manifestationen in Verbindung gebracht. Wie eine CHIKV-Infektion zu Herzerkrankungen führt, ist jedoch noch nicht bekannt. Hier haben wir sowohl Mausmodelle als auch menschliche primäre Herzzellen genutzt, um die Mechanismen der CHIKV-Herzinfektion zu definieren. Anhand eines immunkompetenten Mausmodells einer CHIKV-Infektion sowie menschlicher primärer Herzzellen zeigen wir, dass CHIKV Herzfibroblasten direkt infiziert und sich aktiv in ihnen repliziert. Bei immunkompetenten Mäusen wird CHIKV ohne nennenswerten Schaden aus dem Herzgewebe entfernt, indem eine lokale Typ-I-Interferon-Reaktion sowohl von infizierten als auch nicht infizierten Herzzellen induziert wird. An Mäusen, denen wichtige Signalkomponenten der angeborenen Immunität fehlen, haben wir herausgefunden, dass die Signalübertragung über das mitochondriale antivirale Signalprotein (MAVS) für die Virusclearance aus dem Herzen erforderlich ist. Ohne MAVS-Signalisierung führt eine anhaltende Infektion zu einer fokalen Myokarditis und Vaskulitis der großen Gefäße an der Herzbasis. Bis zu 60 Tage nach der Infektion wurde eine Vaskulitis großer Gefäße beobachtet, was darauf hindeutet, dass CHIKV zu Gefäßentzündungen und möglicherweise langanhaltenden kardiovaskulären Komplikationen führen kann. Diese Studie liefert ein Modell einer CHIKV-Herzinfektion und mechanistische Einblicke in CHIKV-induzierte Herzerkrankungen und unterstreicht die Bedeutung der Überwachung der Herzfunktion bei Patienten mit CHIKV-Infektionen.

Von Arthropoden übertragene Viren (Arboviren) wie das Zika-Virus, das Dengue-Virus und das Chikungunya-Virus (CHIKV) werden mit der Entwicklung von Kardiomyopathien bei Patienten in Verbindung gebracht1,2,3,4,5,6. CHIKV-assoziierte Herzmanifestationen wurden in mehr als 15 Ländern weltweit gemeldet5,7. Herzkomplikationen treten innerhalb der ersten Woche nach Symptombeginn5 auf und umfassen Symptome, die von Arrhythmien, Vorhofflimmern, abnormalen Echokardiogrammen und Elektrokardiogrammen8, einer Verringerung der Ejektionsfraktion6, Myokarditis8,9,10 bis hin zu Herzversagen und Tod9,11,12,13 reichen . Autopsien von Personen, die einer CHIKV-Infektion erlegen sind, zeigen das Vorhandensein von CHIKV-Antigen im Herzgewebe12,14 und eine Infiltration von Immunzellen, was auf eine virale Myokarditis hinweist, sowie Anzeichen von Herzödem, Endokarditis, Nekrose und Herzstauung9. Tatsächlich waren mehr als 20 % der CHIKV-bedingten Mortalitätsfälle mit Herzkomplikationen verbunden9,12,15. Obwohl die meisten Herzkomplikationen bei älteren Erwachsenen und Personen mit Komorbiditäten beobachtet wurden11,16, wurden kardiale Manifestationen im Zusammenhang mit CHIKV-Infektionen bei jungen Personen, einschließlich Kindern und Säuglingen ohne bekannte Komorbiditäten, berichtet6,8,9.

Während frühere Studien über einen Zusammenhang zwischen CHIKV und einer Infektion von Herzgewebe in Tiermodellen berichteten17,18,19,20,21, bleiben mehrere Fragen unbeantwortet: (i) Ist Herzgewebe ein direktes Ziel einer CHIKV-Infektion und ein Ort der aktiven Replikation bei immunkompetenten Patienten? Gastgeber?; (ii) Was sind die Mechanismen der CHIKV-Herzgewebe-Interaktion?; (iii) Wie reagiert das Herz auf eine CHIKV-Infektion?; und (iv) wie führt eine CHIKV-Infektion zu Herzerkrankungen?

Hier zeigen wir anhand eines immunkompetenten Mausmodells einer CHIKV-Infektion sowie menschlicher primärer Herzzellen, dass CHIKV Herzgewebe direkt infiziert und sich aktiv darin repliziert, wobei Herzfibroblasten das wichtigste zelluläre Ziel einer CHIKV-Infektion sind. Wir zeigen, dass CHIKV das Myokard, die Klappen, den Vorhof und die Gefäße infiziert und dass virale RNA im Gewebe, das Vorhof und Gefäße enthält, im Vergleich zum Myokard länger persistiert. Wir zeigen, dass eine CHIKV-Herzinfektion bei immunkompetenten Mäusen schnell und ohne Anzeichen einer Gewebeentzündung oder Herzgewebeschädigung beseitigt wird, was mit einer lokalen Typ-I-Interferon (IFN-I)-Reaktion einhergeht. Tatsächlich induziert eine Infektion des Herzgewebes eine lokale IFN-I-Reaktion sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Herzzellen, und der Verlust der IFN-I-Signalübertragung führt zu einer Zunahme infektiöser CHIKV-Partikel, einer Virusausbreitung und Apoptose im Herzgewebe. Wir zeigen, dass die IFN-I-Reaktion für die Kontrolle der CHIKV-Infektion in menschlichen primären Herzfibroblasten von wesentlicher Bedeutung ist. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Signalübertragung über das mitochondriale antivirale Signalprotein (MAVS), einen zentralen Knotenpunkt für die Signaltransduktion, die durch die zytosolischen Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) RIG-I oder MDA5 initiiert wird, für eine effiziente CHIKV-Clearance erforderlich ist, wobei virale Partikel vorhanden sind bis zu 10 Tage nach der Infektion (dpi) in Mavs−/− Mäusen nachgewiesen. Wichtig ist, dass wir herausgefunden haben, dass die Persistenz einer CHIKV-Infektion im Herzgewebe von Mavs-/−-Mäusen zu einer Schädigung des Herzgewebes führt, die durch CD3+- und CD11b+-Infiltrate im Myokard und Vorhof sowie in den großen Gefäßen an der Basis des Herzens gekennzeichnet ist. wie der Aorta (Ao) und der Pulmonalarterie (PA). Interessanterweise wurde eine virale Myokarditis bei 10 und 15 dpi festgestellt, während eine Vaskulitis großer Gefäße mit Beteiligung von Ao und PA bis zu 60 dpi andauerte, was darauf hindeutet, dass eine Infektion des Herzgewebes durch CHIKV zu Gefäßentzündungen und möglicherweise langanhaltenden kardiovaskulären Komplikationen führen kann.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass eine robuste IFN-I-Reaktion und MAVS-Signalisierung erforderlich sind, um eine CHIKV-Infektion im Herzen zu kontrollieren und fokale Myokarditis sowie Ao- und PA-Vaskulitis zu verhindern. Insgesamt liefert diese Studie mechanistische Erkenntnisse darüber, wie CHIKV zu Herzschäden führen kann. Sie unterstreicht die Bedeutung der Überwachung der Herzfunktion bei Patienten mit CHIKV-Infektionen und ebnet den Weg zur Identifizierung von Risikofaktoren, die mit der Entwicklung von CHIKV-induzierten Herzkomplikationen verbunden sind.

Während das Vorhandensein von CHIKV-Virusprodukten im Herzgewebe infizierter Tiere nachgewiesen wurde17,18,19,20,21, bleibt unklar, ob CHIKV Herzzellen infiziert und sich darin repliziert. Herzgewebe wird stark durchblutet; Daher ist es wichtig zu überprüfen, ob das in Herzhomogenaten nachgewiesene Virus aus infizierten Herzzellen und nicht aus zirkulierenden Viren stammt. Um dieses Problem anzugehen, haben wir die Wirkung der Perfusion an den hochanfälligen Mäusen mit Interferon-α/β-Rezeptor-Mangel (Ifnar1−/−) getestet, einem Mausmodell, bei dem infektiöse CHIKV-Partikel in nicht perfundierten Herzen nachgewiesen wurden20. Während perfundiertes Gewebe nachweisbare Mengen an CHIKV-RNA aufwies, waren diese im Vergleich zu nicht perfundierten Mäusen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 1a). Daher haben wir in alle unsere Experimente einen Perfusionsschritt integriert. Um festzustellen, ob Herzgewebe ein direktes Ziel einer CHIKV-Infektion bei immunkompetenten Mäusen ist, infizierten wir Mäuse entweder subkutan durch Fußballeninjektion, intravenös durch Injektion in die Schwanzvene oder durch natürliche Übertragung durch Mückenstiche. Wir haben das infektiöse CHIKV-Virus anhand der mittleren infektiösen Gewebekulturdosis (TCID50) in BHK-21-Zellen und die CHIKV-RNA mittels RT-qPCR quantifiziert. Wir konnten CHIKV-Genome und infektiöse Partikel aus perfundierten Herzen in infizierten Mäusen unabhängig vom Inokulationsweg nachweisen (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1b), was das Herzgewebe als echtes Ziel einer CHIKV-Infektion unterstützt. Um zu beurteilen, ob sich die im Herzen nachgewiesenen CHIKV-Viruspartikel aktiv replizierten, haben wir das Verhältnis zwischen CHIKV-nsp4- und E1-Transkripten mittels RT-qPCR als Ersatz für genomische bzw. subgenomische RNA bei 2, 5 und 10 dpi gemessen. Als nicht-replikative Kontrolle infizierten wir Mäuse mit hitzeinaktiviertem (HI) CHIKV. Während für die HI-Kontrolle keine aktive Replikation festgestellt wurde, wurde eine aktive CHIKV-Replikation im Herzen sowohl für subkutane als auch für intravenöse Inokulationswege festgestellt (Abb. 1b). Bei intravenös infizierten Mäusen wurde eine aktive Replikation bei 2 dpi (R [Verhältnis E1/nsp4] = 3,81, p = 0,047) und 5 dpi (R = 8,11, p = 0,008) nachgewiesen, während bei subkutan infizierten Mäusen eine aktive Replikation bei 5 festgestellt wurde dpi (R = 3,88, p = 0,008). Der Unterschied in der Kinetik zwischen den Inokulationswegen steht im Einklang mit der Notwendigkeit einer subkutanen Inokulation, um Virämie zu erreichen, um Herzgewebe zu verbreiten und zu infizieren, während der intravenöse Weg dieses Stadium der Infektion umgeht. Diese Ergebnisse zeigen, dass Herzgewebe ein direktes Ziel einer CHIKV-Infektion bei immunkompetenten Mäusen ist.

a Sechs Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden mit 1E5 PFU von CHIKV geimpft oder scheininfiziert, wie in jedem Panel angegeben. Subkutan: CHIKV-infiziert (n = 11) und scheininfiziert (n = 5). Intravenös: CHIKV-infiziert (n = 11) und scheininfiziert (n = 8). Mückenstich CHIKV-infiziert (n = 11) und scheininfiziert (n = 9). b Verhältnis von E1-Virus-RNA zu NSP4-Virus-RNA. Die gepunktete Linie zeigt das E1-RNA:nsp4-RNA-Verhältnis (R) von 1 an. Subkutan: 2 dpi (n = 4), 5 dpi (n = 8) und 10 dpi (n = 4). Intravenös: 2 dpi (n = 6), 5 dpi (n = 6) und 10 dpi (n = 4). HI-Steuerung: 2 dpi (n = 3), 5 dpi (n = 6) und 10 dpi (n = 4). c Repräsentative Bilder aus 2 unabhängigen Experimenten, die infiziertes Myokard (Maßstab = 20 μm) und Aortenklappe, linke Vorhöfe und Gefäße (Maßstab = 30 μm) zeigen. Weiße Pfeile: CHIKV-infizierte Zellen. d Mäuse wurden intravenös mit 1E5 PFU des CHIKV- oder HI-Virus infiziert. Linkes Feld: CHIKV-RNA-Spiegel für obere und untere Herzen. Rechtes Feld: Verhältnis der viralen RNA-Spiegel zwischen oberen und unteren Herzabschnitten. Für 2 dpi n = 5, für 5 dpi n = 5, für 10 dpi n = 3. Das graue Feld stellt die Hintergrund-RNA-Werte dar, die für die HI-Kontrolle bei 5 dpi (n = 1) quantifiziert wurden. e Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder aus drei unabhängigen Experimenten ventrikulärer Abschnitte von CHIKV-infizierten Herzen, gefärbt mit verschiedenen Markern für Herzzelltypen. Maßstab = 15 μm. f Kolokalisierungsanalyse zwischen CHIKV-infizierten Zellen und verschiedenen Zelltypmarkern. Die Daten werden als Prozentsatz des gesamten grünen Signals (infizierte Zellen) dargestellt, das mit den angegebenen Markierungen überlappt. Die Kolokalisierungsanalyse wurde in 3–4 unabhängigen Feldern für n = 3 Mäuse durchgeführt. g CHIKV-Mehrzyklus-Wachstumskurven in menschlichen primären Herzzellen. n = 2 unabhängige Experimente in technischen Duplikaten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt (SEM, a, b, d, f, g). p-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests (a, b) oder des Mehrfachvergleichstests von Kruskal-Wallis und Dunn (d, f) berechnet. Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Lokalisierung einer CHIKV-Infektion im Herzgewebe zu bestimmen, verwendeten wir ein Reporter-CHIKV, das das ZsGreen-Fluoreszenzprotein (CHIKV-ZsGreen) ausschließlich unter aktiver Virusreplikation exprimiert17. Mäuse wurden mit CHIKV-ZsGreen infiziert und Herzgewebe wurde mit 2 dpi entnommen. Wir beobachteten mehrere ZsGreen-positive Herde, die CHIKV-infizierten Zellen bei Mäusen entsprachen, die sowohl intravenös (Abb. 1c) als auch subkutan (ergänzende Abb. 1c) infiziert waren. CHIKV infiziert verschiedene Strukturen des Herzgewebes, wobei infizierte Zellen im Myokard, in den Aortenklappen, im Vorhof und in den Gefäßen vorhanden sind (Abb. 1c). Mit dem Ziel, die Unterschiede im Infektionsgrad im gesamten Herzgewebe zu messen, haben wir das Herz physisch unterteilt in: (i) den oberen Abschnitt (der Vorhöfe enthält und mit Gefäßen an der Basis des Herzens angereichert ist, wie z. B. die aufsteigende Brustaorta) und (ii) unterer Abschnitt (angereichert mit dem Myokard); und bewertete die Kinetik der CHIKV-Infektion. Um einer direkten Infektion des Herzgewebes entgegenzuwirken und die mit Unterschieden in der Verbreitung verbundenen Schwankungen zu umgehen, verwendeten wir, sofern nicht anders angegeben, den intravenösen Infektionsweg. Wir fanden heraus, dass sich CHIKV zwar sowohl im oberen als auch im unteren Bereich des Herzens bei 2 dpi effizient replizieren kann (R = 1,47; Abb. 1d, linkes Feld), CHIKV-RNA-Genome jedoch im oberen Bereich, der die Gefäße und Vorhöfe enthält, länger bestehen bleiben (5 dpi: R = 5,07 und 10 dpi: R = 6,35, Abb. 1d, rechtes Feld). Tatsächlich fanden wir heraus, dass der obere Teil des Herzens im Vergleich zum unteren Teil größere Mengen viraler Genome enthält (Abb. 1d). Diese Ergebnisse belegen, dass verschiedene Strukturen des Herzgewebes nicht gleichermaßen anfällig für eine CHIKV-Infektion sind und dass der Abschnitt mit großen Gefäßen einer höheren CHIKV-Viruslast ausgesetzt ist.

Um die spezifischen Zelltypen zu identifizieren, die mit CHIKV im Herzgewebe infiziert sind, wurden Herzen mit 2 dpi entnommen, fixiert und verarbeitet, um serielle Kryoschnitte zu erhalten, gefolgt von einer Färbung mit Markern für bestimmte Herzzelltypen: CD31 (Endothelzellen), CD45 (Leukozyten), αSMA (glatte Muskelzellen, Perizyten und Myofibroblasten), cTnT (Herzmuskelzellen) und Vimentin. Bemerkenswert ist, dass Vimentin in hohen Konzentrationen in Herzfibroblasten exprimiert wird22, aber auch in glatten Muskelzellen, Endothelzellen und Makrophagen exprimiert werden kann23,24,25. Daher identifizierten wir Herzfibroblastenzellen als Vimentin+/αSMA−/CD31−/CD45− Populationen, eine Kombination, die wir durch Einzelzell-RNA-Expression aus der Tabula Muris26 orthogonal validierten (ergänzende Abbildung 1d). Durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Kolokalisierungsanalyse mit den verschiedenen Zelltypmarkern stellten wir fest, dass 78, 5% des CHIKV-ZsGreen-Signals mit Vimentin + / αSMA--Zellen kolokalisierten (Abb. 1e, f und ergänzende Abb. 1e, f). Dieses Ergebnis, zusammen mit der verringerten Kolokalisierung zwischen CHIKV-ZsGreen-Signal und Markern für Endothelzellen (CD31+; 7,63 %), Leukozyten (CD45+; 7,16 %), glatte Muskulatur/Perizyten/Myofibroblasten (αSMA+; 0,38 %) und Herzmuskelzellen ( cTnT+; 4,39 %; Abb. 1f; ergänzende Abb. 1f) zeigen, dass die Herzfibroblasten das primäre Ziel einer CHIKV-Infektion des Herzgewebes in vivo sind.

Schließlich wollten wir herausfinden, ob menschliche Herzzellen eine ähnliche Anfälligkeit für eine CHIKV-Infektion aufweisen wie die bei Mäusen beobachteten. Zu diesem Zweck haben wir die Fähigkeit von CHIKV untersucht, menschliche primäre Herzzellen in vitro zu infizieren. Wir infizierten menschliche primäre Herzfibroblasten (hCF), menschliche Herzmuskelzellen (hCM) und menschliche Herzmikrogefäß-Endothelzellen (hCE) mit einer MOI von 0,1 und maßen die Produktion infektiöser Partikel. Wir fanden heraus, dass CHIKV hCF effizient infizieren kann (Abb. 1g, schwarze Kreise), aber kein hCE (Abb. 1g, Quadrate), was unsere In-vivo-Beobachtungen bei Mäusen stützt. Interessanterweise produzierte hCM in Kultur CHIKV-infektiöse Partikel in ähnlichen Mengen wie bei hCFs (Abb. 1g, offene Kreise). Dieses Ergebnis muss jedoch sorgfältig interpretiert werden, da hCMs in Kultur spezifische Merkmale verlieren, die sich möglicherweise auf die Anfälligkeit für eine CHIKV-Infektion auswirken können. Während beispielsweise Herzmuskelzellen im Gewebe in vivo dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mehrkernig und ruhend sind, kehrt die In-vitro-Kultur diese Phänotypen um, was zu einkernigen und proliferierenden Zellen führt27.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass sich CHIKV aktiv im Herzgewebe repliziert, wobei Herzfibroblasten das primäre zelluläre Ziel einer CHIKV-Infektion bei immunkompetenten Mäusen sind.

Um die Folgen der CHIKV-Replikation im Herzgewebe zu bewerten, haben wir die Kinetik der CHIKV-Infektion im Herzen sowie Herzschäden, Apoptose und Entzündungen gemessen. Bereits 12 Stunden nach der Infektion (hpi) wurden im Herzen intravenös infizierter Mäuse signifikante Mengen an CHIKV-RNA mit einem Spitzenwert von 2 dpi nachgewiesen, und die Infektion wurde bei 9 dpi auf Hintergrundnachweisniveaus beseitigt (Abb. 2a, links). Panel). Infektiöse Partikel folgen einem ähnlichen Trend, wobei der Höhepunkt der infektiösen Partikelproduktion zwischen 1 und 2 dpi liegt und bei 9 dpi keine nachweisbaren Werte vorliegen (Abb. 2a, rechtes Feld). Interessanterweise folgt die Virusreplikationskinetik, wenn auch bei höheren CHIKV-RNA-Spiegeln, einem ähnlichen zeitlichen Muster, wenn sie im Wadenmuskel, einem primären Organ der CHIKV-Replikation, gemessen wird (ergänzende Abbildung 2a). Daher zeigen diese Ergebnisse, dass eine CHIKV-Infektion bei immunkompetenten Mäusen effizient vom Herzgewebe befreit wird.

a Oberes Feld: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Unteres Feld: CHIKV-Virusgenome oder CHIKV-infektiöse Partikel aus Herzgewebehomogenaten, bestimmt durch RT-qPCR bzw. TCID50. CHIKV-Virusgenome: HI-Kontrolle (n = 39), 6 hpi (n = 5), 12 hpi (n = 5), 1 dpi (n = 9), 2 dpi (n = 18), 3 dpi (n = 7), 5 dpi (n = 13), 9 dpi (n = 8) und 21 dpi (n = 8). Infektiöse Partikel, HI-Kontrolle (n = 18), 6 hpi (n = 5), 12 hpi (n = 5), 1 dpi (n = 9), 2 dpi (n = 8), 3 dpi (n = 7 ), 5 dpi (n = 4) und 9 dpi (n = 4). b Serumspiegel von kardialem Troponin-T, gemessen durch ELISA: scheininfiziert (n = 23), 2 dpi (n = 33) und 5 dpi (n = 14). c Quantifizierung der gespaltenen CASP3-Kerne im Vergleich zur Gesamtkernzahl gefärbter ganzer ventrikulärer Abschnitte (siehe „Methoden“). n = 3/Gruppe. d Diagramm, das die relativen Proteinspiegel proinflammatorischer Zytokine und Chemokine zwischen CHIKV- und scheininfizierten Herzhomogenaten bei 2 und 5 dpi zeigt. Der relative Ausdruck wird in der log2-fachen Änderung (Rautengröße) dargestellt. Die statistische Signifikanz wird als Farbskala ausgedrückt (-Log10 angepasster p-Wert). 2 dpi: HI-Kontroll- und CHIKV-infizierte Herzen (n = 6/Gruppe). 5 dpi: HI-Kontrolle (n = 4) und CHIKV-infizierte Herzen (n = 5). e Volcano-Diagramme aus der Differentialexpressionsanalyse bei 2 dpi (linkes Feld) und 5 dpi (rechtes Feld). Rot und Blau zeigen hochregulierte (FDR < 0,15 und log2(FC) > 1) bzw. herunterregulierte Gene (FDR < 0,15 und log2(FC) < −1) an. Die 10 am häufigsten differenziell exprimierten Gene sind angegeben. n = 4 Mäuse/Gruppe. f GSEA-Signalweganreicherungsanalyse für Hallmark-Datensätze, die die am häufigsten hochregulierten und herunterregulierten Signalwege bei 2 dpi und 5 dpi zeigt. n = 4 Mäuse/Gruppe. Boxplots zeigen Median- und Quartilbereiche, Whisker stellen den Bereich dar (a, b). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (c) dargestellt. p-Werte wurden mithilfe des Mehrfachvergleichstests von Kruskal-Wallis und Dunn (a) und der einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleich von Dunnett (b, c) berechnet. Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Erhöhte kardiale Troponine wurden bei Personen mit CHIKV-assoziierten kardialen Manifestationen beobachtet6,7,13,16. Um festzustellen, ob CHIKV bei Mäusen zu Herzschäden führen kann, haben wir die Serumspiegel von kardialem Troponin-T (cTnT) bei 2 und 5 dpi mittels ELISA bewertet. Wir beobachteten keine signifikanten Unterschiede im kardialen Troponin-T-Spiegel im Serum zwischen infizierten und PBS- oder HI-Kontrollen (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass die CHIKV-Replikation keine Schädigung der Herzmuskelzellen hervorruft. Tatsächlich wurden bei 3 oder 5 dpi keine Anzeichen einer Apoptose des Herzgewebes beobachtet (Abb. 2c, positive Färbungskontrolle in ergänzender Abb. 2b). Daher wird bei WT-Mäusen nach einer CHIKV-Infektion und -Beseitigung kein Herzschaden beobachtet.

Obwohl bei CHIKV bei WT-Mäusen keine Herzschädigung beobachtet wurde, fanden wir heraus, dass eine CHIKV-Infektion die Proteinproduktion von proinflammatorischem Zytokin und Chemokin im Herzgewebe stimuliert (CCL2, CCL5, CCL3, TNFα, IL6, IFNγ, IL2, KC, IL1α, IL12p70, und IL12p40) mit 2 dpi. IL12p40 ist jedoch das einzige Zytokin, das bei 5 dpi hochreguliert bleibt (Abb. 2d; ergänzende Abb. 2c, d), was darauf hinweist, dass eine CHIKV-Infektion einen vorübergehenden Entzündungszustand im Herzgewebe auslöst. Die histopathologische Analyse der Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung von Vierkammer-Ansichtsschnitten von Infizierten und Scheininfizierten bei 3, 5, 10 und 15 dpi (Supplementary Data 1) ergab keine sichtbaren mononukleären Zellinfiltrate in Ventrikeln, Septum oder Vorhöfen von CHIKV-infizierten Herzen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Herzgewebe eine CHIKV-Infektion bei immunkompetenten Mäusen effizient und ohne nennenswerten Herzschaden beseitigen kann.

Um zu verstehen, wie das Herz eine CHIKV-Infektion bei WT-Mäusen schnell beseitigt, ohne das Herzgewebe zu schädigen, haben wir die Transkriptionsreaktion von CHIKV-infizierten Herzhomogenaten durch Bulk-RNA-Sequenz gemessen. Wir verwendeten CHIKV-infizierte Mäuse bei 2 dpi (wo wir sowohl CHIKV-RNA als auch infektiöse CHIKV-Partikel nachweisen) oder bei 5 dpi (wo wir wenig bis keine infektiösen CHIKV-Partikel nachweisen, aber CHIKV-RNA-Spiegel nachweisen; Abb. 2a). Um Veränderungen zu identifizieren, die nur auf die aktive CHIKV-Replikation zurückzuführen sind, verwendeten wir das HI-Virus als Kontrolle. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass biologische Replikate nach Behandlung gruppiert wurden (ergänzende Abbildung 3a). Insgesamt wurden 377 hochregulierte Gene und 84 herunterregulierte Gene bei 2 dpi und 259 hochregulierte Gene sowie 52 herunterregulierte Gene bei 5 dpi nachgewiesen (Abb. 2e, ergänzende Abb. 3b, c; ergänzende Daten 2 und 3). Zu den Top 10 der hochregulierten Gene an beiden Tagen gehören Gene, die mit dem Schutz vor Herzgewebeschäden und dem Mitochondrienstoffwechsel (Apod, Atf5, Mthfd2)28,29, der IFN-I-Reaktion (Ifi27, ​​Ddx60, Serping1) und der Zytokinsignalisierung (H2-K1) verbunden sind ) und Komplementkaskade (C4a, C4b, C1ra) (Abb. 2e). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigt die GSEA-Signalweganreicherungsanalyse für Reactome- und Hallmark-Datensätze eine Hochregulierung (FDR < 0,15 und normalisierter Anreicherungsscore [NES] > 0) mehrerer Signalwege, die mit angeborener Immunität, adaptiver Immunität und IFN-Signalübertragung verbunden sind (Abb. 2f, Ergänzung). Abb. 3c und ergänzende Daten 2 und 3 sowie ergänzende Tabellen 2 und 3). Zu den herunterregulierten Signalwegen (FDR < 0,15 und NES < 0) in infizierten Herzhomogenaten bei 5 dpi gehören unter anderem Stoffwechselwege wie der Stoffwechsel von Aminosäuren, der respiratorische Elektronentransport und die oxidative Phosphorylierung (ergänzende Abbildung 3c).

Die Induktion von IFN-I-Signalwegen in nicht-hämatopoetischen Zellen ist für die Kontrolle der CHIKV-Infektion bei Säugetieren von entscheidender Bedeutung30,31. Wir fanden heraus, dass der IFN-I-Signalweg in CHIKV-infizierten Herzen sowohl bei 2 als auch bei 5 dpi signifikant induziert wird (Abb. 3a und ergänzende Abb. 3e). Insbesondere beobachteten wir eine Hochregulierung von Interferon-stimulierten Genen (ISGs; z. B. Isg15, Ifitm3, Mx1, Mx2, Ifit1, Ifit2, Ifit3, Ifi27, ​​Ddx58 und Ddx60 unter anderem) sowie von Genen, die am IFN-I-Signalweg beteiligt sind ( z. B. Irf7, Stat1, Stat2; Zusatzdaten 2 und 3). Während die Serum-IFNα- und IFNβ-Spiegel bei 24 hpi erhöht waren, wurden in infizierten Herzen bei 12 oder 24 hpi keine Veränderungen der lokalen IFNα- und IFNβ-Spiegel beobachtet (ergänzende Abbildung 3f). Dies legt nahe, dass zirkulierendes IFN-I zur lokalen IFN-I-Reaktion beiträgt, die durch das Herzgewebe bei einer CHIKV-Infektion ausgelöst wird.

eine Wärmekarte, die die unterschiedlich exprimierten Gene (FDR < 0,15) aus dem Hallmark IFNα-Reaktionsweg für CHIKV-infizierte und HI-Kontrollherzen zeigt. b Oberes Feld: repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder aus zwei unabhängigen Wiederholungen, die ventrikuläre Abschnitte von CHIKV-infizierten Herzen und PBS-Kontrolle zeigen, gefärbt mit Anti-ISG15- und Anti-Vimentin-Antikörpern. Maßstab = 10 μm. Unteres Feld: Quantifizierung des ISG15+-Signals/Feldes. Die Analyse erfolgte auf zwei unabhängigen Feldern zur PBS-Kontrolle (n = 2) und CHIKV-infizierten Feldern (n = 6). c Abhängigkeit von der IFN-I-Signalübertragung in menschlichen primären Herzfibroblasten während einer CHIKV-Infektion. Die Zellen wurden wie in der Abbildung angegeben vorbehandelt und mit CHIKV-ZsGreen bei einer MOI von 0,25 infiziert. Die Daten stellen drei unabhängige Wiederholungen in technischen Duplikaten dar. d IFN-I-Vorbehandlungsexperimente in menschlichen primären Herzzelltypen. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen an rekombinantem IFN-α (rechtes Feld) und IFN-β (linkes Feld) vorbehandelt und dann 24 Stunden lang mit CHIKV-ZsGreen bei einer MOI von 0,25 infiziert. Für IFN-α: drei unabhängige Wiederholungen in technischen Duplikaten. Für IFN-β: vier unabhängige Wiederholungen in technischen Duplikaten. e Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder aus drei unabhängigen Wiederholungen, die CHIKV-ZsGreen WT- oder Ifnar1−/−-infizierte Herzen bei 1 dpi zeigen. Maßstab = 30 μm. f Prozentsatz der Gesamtzahl der infizierten Zellen (grünes Signal), die sich mit den angegebenen Herstellern überlappen (siehe ergänzende Abbildung 1d, e). Die Kolokalisierungsanalyse wurde in drei bis fünf unabhängigen Abschnitten für n = 2 Mäuse durchgeführt. g Linkes Feld: Die Apoptose-Färbung wurde durch IHC gegen gespaltenes CASP3 gemessen. Maßstab = 50 μm. Pfeile markieren apoptotische Herde. Rechtes Feld: Quantifizierungen der gespaltenen CASP3-Kerne im Vergleich zur Gesamtkernzahl wurden in ganzen ventrikulären Abschnitten (LV, RV und Septum) mit VisiopharmR durchgeführt. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Maus. PBS-Kontrolle (n = 5), CHIKV-infizierte WT (n = 5) und CHIKV-infizierte Ifnar1-/-Mäuse (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (b–d, f, g) dargestellt. Die P-Werte wurden mithilfe der zweiseitigen Mann-Whitney-Methode (b) oder der einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett (c, d, g) oder Kruskal-Wallis mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn (f) berechnet. Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um Erkenntnisse darüber zu gewinnen, ob die durch RNA-seq beobachtete IFN-I-Reaktion lokal durch infizierte Herzfibroblasten vermittelt wurde, haben wir die lokale Proteinproduktion von ISG15 und IFITM3 gemessen, beides ISGs, von denen bekannt ist, dass sie die CHIKV-Infektion einschränken32,33, und stellten fest, dass beide hochreguliert waren bei 2 dpi in CHIKV-infizierten Herzen (Abb. 3a und ergänzende Abb. 3d). Während IFITM3 in Abwesenheit einer Interferon-Induktion auf Grundniveau exprimiert wird, wird seine Expression stark entweder durch IFN-I oder Interferon-γ34 induziert. Wir fanden heraus, dass 95 % der CHIKV-infizierten Zellen positiv für den IFITM3-Marker sind. In Abwesenheit des IFN-I-Rezeptors (Ifnar1-/-Mäuse) kolokalisieren jedoch nur 24,6 % der CHIKV-infizierten Zellen mit dem IFITM3-Signal (ergänzende Abbildung 4a), was zeigt, dass die beobachtete Reaktion teilweise von IFN-I abhängt. ICH. Die lokale Produktion von ISG15- und IFITM3-Proteinen wurde im Herzgewebe nach einer CHIKV-Infektion sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Vimentin+-Zellen nachgewiesen (Abb. 3b und ergänzende Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass Herzfibroblasten neben anderen Vimentin+-Zellen die wichtigsten IFN-I-Responder sind in infiziertem Herzgewebe.

Als nächstes wollten wir die Bedeutung der IFN-I-Signalübertragung bei der Infektion menschlicher Herzfibroblasten (hCFs) durch CHIKV bestimmen. Wir haben dies bewertet, indem wir: (i) die Fähigkeit von hCFs gemessen haben, nach Poly(I:C)-Stimulation und CHIKV-Infektion eine robuste IFN-I-Antwort zu erzeugen; (ii) Messung der Anfälligkeit dieser Zellen für eine CHIKV-Infektion in Abwesenheit einer IFN-I-Signalisierung unter Verwendung des JAK1/JAK2-Inhibitors Ruxolitinib (Rux); und (iii) Herbeiführung eines refraktären Zustands bei steigenden Dosen von IFN-I-Vorbehandlungen. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass hCFs effizient auf Poly(I:C)-Stimulation reagieren, was dazu führt, dass ~88 % der Monoschicht ISG15 exprimieren (Abb. 3c, linkes Feld). In Übereinstimmung mit unseren In-vivo-Daten stellten wir fest, dass infizierte hCFs auf eine CHIKV-Infektion reagierten, indem sie signifikante Mengen an ISG15 produzierten (Abb. 3c, linkes Feld). Darüber hinaus erhöhte die Rux-Behandlung den Prozentsatz CHIKV-infizierter Zellen signifikant (Abb. 3c, rechtes Feld) und korrelierte mit einer Verringerung der ISG15-Produktion (Abb. 3c, linkes Feld). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die exogene Zugabe von IFNα oder IFNβ eine CHIKV-Infektion dosisabhängig verhinderte, wobei IFNβ eine erhöhte Blockierungskapazität zeigte (Abb. 3d). Diese Ergebnisse belegen, dass die IFN-I-Signalübertragung für die Kontrolle der CHIKV-Infektion in menschlichen Herzfibroblasten von entscheidender Bedeutung ist.

Schließlich untersuchten wir den direkten Beitrag der IFN-I-Reaktion zur Kontrolle der CHIKV-Herzinfektion und zur Verhinderung von Gewebeschäden durch die Verwendung von Ifnar1-/-Mäusen. Wie erwartet beobachteten wir, dass ohne IFN-I-Signalisierung die CHIKV-Ausbreitung und die Produktion infektiöser Partikel im Herzgewebe von Ifnar1-/--Mäusen im Vergleich zu immunkompetenten WT-Mäusen erhöht waren (Abb. 3e und ergänzende Abb. 4b). Dieser Anstieg der Produktion infektiöser Partikel wurde auch im Wadenmuskel beobachtet, einem primären Ort der CHIKV-Infektion, jedoch nicht in einem Nicht-CHIKV-Zielorgan wie der Bauchspeicheldrüse (ergänzende Abbildung 4b). Während Herzfibroblasten (Vimentin+/aSMA-; 42 %) immer noch das primäre Ziel einer CHIKV-Infektion im Herzgewebe bei Ifnar1–/– Mäusen darstellen, beobachteten wir einen erhöhten Anteil endothelial infizierter Zellen (CD31+; 16,5 %, Abb. 3f und Ergänzende Abbildung 3c) relativ zum WT (Abb. 1f). Interessanterweise kolokalisierten bei Ifnar1-/−-Mäusen nur 7,8 % der infizierten Zellen mit dem cTnT-Marker (Abb. 3f und ergänzende Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass Herzmuskelzellen auch ohne IFN-I-Reaktion kein Ziel darstellen einer CHIKV-Infektion bei Mäusen. Um festzustellen, ob die beobachtete erhöhte Infektion bei Ifnar1-/−-Mäusen auch ohne Herzmuskelzelleninfektion zu Herzschäden führt, haben wir die Apoptose des Herzgewebes durch gespaltene CASP3-Färbung bei 1 dpi beurteilt. Wir beobachteten, dass die Infektion von WT-Mäusen im Vergleich zur scheininfizierten Kontrolle ähnliche Werte an gespaltenem CASP3-Signal aufwies, während Ifnar1-/−-Mäuse einen signifikant erhöhten Spiegel an gespaltenem CASP3 im Myokard aufwiesen (Abb. 3g), was eine uneingeschränkte CHIKV-Infektion zeigt kann zu einer Schädigung des Herzgewebes führen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass eine lokale IFN-I-Reaktion wichtig ist, um eine CHIKV-Infektion im Herzen zu kontrollieren und Herzgewebeschäden zu verhindern.

Die IFN-I-Signalisierung wird bei der Erkennung von CHIKV-RNA entweder über zytosolische (RIG-I/MDA5) oder endosomale Rezeptoren (TLR3/7) ausgelöst35. Um Einblicke in die Mechanismen zu erhalten, wie Herzgewebe eine CHIKV-Infektion bekämpft, nutzten wir Mäuse, denen wichtige Signalkomponenten des angeborenen Immunsystems wie MYD88, TRIF oder MAVS fehlen. Um außerdem den Beitrag des NLRP3-Inflammasoms zur CHIKV-Clearance36,37 zu untersuchen, verwendeten wir Mäuse mit CASPASE 1/11-Mangel. Wir infizierten jede Maus intravenös mit CHIKV und bewerteten die Viruslast im Herzgewebe bei 2, 5 und 7 dpi. Interessanterweise fanden wir zwar keine signifikanten Unterschiede in der Infektionskinetik zwischen Myd88 −/−-, Trif Lps2/Lps2- oder Casp1/11−/−-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen, bei Mavs−/−-Mäusen waren infektiöse Partikel jedoch bis zu 7 dpi nachweisbar ( Abb. 4a). Tatsächlich fanden wir heraus, dass die heterozygote Deletion von MAVS zu einem Phänotyp führt, der dem von WT ähnelt, was zeigt, dass der vollständige Verlust von MAVS für eine persistierende CHIKV-Infektion erforderlich ist (ergänzende Abbildung 5a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die MAVS-Signalübertragung zur Beseitigung der CHIKV-Infektion aus infizierten Herzen beiträgt.

a Unterschiedliche Anfälligkeiten für eine CHIKV-Herzinfektion zwischen MyD88−/−-, Trif Lps2/Lps2-, Casp1/11−/−-, Mavs−/−- und WT-Mäusen. WT: 2 dpi (n = 10), 5 dpi (n = 16) und 7 dpi (n = 6). Casp1/11−/−: 2 dpi (n = 5), 5 dpi (n = 8) und 7 dpi (n = 3). MyD88−/−: 2 dpi (n = 4), 5 dpi (n = 6) und 7 dpi (n = 3). Trif Lps2/Lps2: 2 dpi (n = 5), 5 dpi (n = 5) und 7 dpi (n = 4). Mavs−/−: 2 dpi (n = 4), 5 dpi (n = 4) und 7 dpi (n = 4). b, c CHIKV-Herzinfektionskinetik bei Mavs−/−- und WT-Mäusen. b WT: 2 dpi (n = 6), 5 dpi (n = 7), 7 dpi (n = 4), 10 dpi (n = 4) und 15 dpi (n = 2). Mavs−/−: 2 dpi (n = 5), 5 dpi (n = 6), 7 dpi (n = 10), 10 dpi (n = 8) und 15 dpi (n = 4). C. WT: 2 dpi (n = 6), 5 dpi (n = 7), 7 dpi (n = 4), 10 dpi (n = 4) und 15 dpi (n = 2). Mavs−/−: 2 dpi (n = 5), 5 dpi (n = 6), 7 dpi (n = 8), 10 dpi (n = 5) und 15 dpi (n = 4). CHIKV-RNA-Genome aus dem Herzen (d) und aus Wadenmuskelhomogenaten (e). d HI-Kontrolle (n = 6). WT: 1 dpi (n = 5), 2 dpi (n = 6), 10 dpi (n = 4) und 15 dpi (n = 2). Mavs−/−: 1 dpi (n = 9), 2 dpi (n = 5), 10 dpi (n = 8) und 15 dpi (n = 4). e HI-Kontrolle (n = 3). WT: 2 dpi (n = 4), 10 dpi (n = 5) und 15 dpi (n = 3). Mavs−/−: 2 dpi (n = 4), 10 dpi (n = 8) und 15 dpi (n = 4). f Linkes Feld: CHIKV-RNA-Spiegel in den oberen und unteren Herzabschnitten bei 10 dpi. HI-Kontrolle (n = 1), WT (n = 3) und Mavs−/− (n = 3). Rechtes Feld: Verhältnis der viralen RNA-Spiegel zwischen oberen und unteren Herzabschnitten. N = 3/Gruppe. Der WT-Datensatz mit 10 dpi wird mit Abb. 1c geteilt. g Isg15-Expressionsniveaus in mit Mavs–/– und WT CHIKV infizierten Herzen. WT: HI-Kontrolle (n = 4), 12 hpi (n = 4), 24 hpi (n = 5) und 2 dpi (n = 6). Mavs−/−: HI-Kontrolle (n = 4), 12 hpi (n = 9), 24 hpi (n = 9) und 2 dpi (n = 7). Proteinspiegel von IFN-α und INF-β im Herzen (h) und Serum (i) bei 24 hpi. H. HI-Kontrolle (n = 7), WT (n = 5) und Mavs−/− (n = 9). ich. HI-Kontrolle (n = 7), WT (n = 5) und Mavs−/− (n = 7). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (a, dg) angezeigt. Boxplots zeigen Median- und Quartilbereiche, Whisker stellen den Bereich dar (b, c, h, i). Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests (a–i) berechnet. Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes erweiterten wir unsere Analyse im Herzen auf bis zu 15 dpi und stellten fest, dass infektiöse Partikel bis zu 10 dpi erkannt werden können (Abb. 4b), während infektiöse Partikel im Serum sowohl für Mavs −/− als auch für WT um 5 dpi entfernt wurden Mäuse (Abb. 4c). Dementsprechend wurden CHIKV-ZsGreen-infizierte Zellen bis zu 10 dpi sowohl im Myokardbereich als auch in Gefäßen von Mavs - / - Mäusen nachgewiesen (ergänzende Abbildung 5b, c). Um zu beurteilen, ob dieser Mangel an viraler Clearance aus Herzgewebe auch in anderen Geweben beobachtet wird, haben wir die CHIKV-RNA-Spiegel im Wadenmuskel und im Herzen bei 2, 10 und 15 dpi sowohl für WT- als auch für Mavs-/-Mäuse untersucht. Wir fanden heraus, dass sich die Kinetik der CHIKV-Clearance aus dem Wadenmuskel von der aus Herzgewebe unterscheidet. Bei Herzgewebe beobachteten wir eine fortschreitende Clearance der RNA-Spiegel von WT-Mäusen, während wir bei Mavs-/−-Mäusen beobachteten, dass die viralen RNA-Spiegel bis zu 10 dpi aufrechterhalten wurden, wobei ein Rückgang um 15 dpi beobachtet wurde (Abb. 4d). ). Im Wadenmuskel zeigten jedoch sowohl Mavs-/−- als auch WT-Mäuse im Laufe der Zeit eine fortschreitende Verringerung der viralen RNA, und bei 10 dpi wurden keine signifikanten Unterschiede in der CHIKV-RNA beobachtet (Abb. 4e). Interessanterweise beobachteten wir bei der Auswertung der CHIKV-RNA-Spiegel im oberen oder unteren Abschnitt des Herzens bei 10 dpi höhere virale RNA-Spiegel in den oberen Abschnitten im Vergleich zu den unteren Abschnitten (Abb. 4f). Diese Ergebnisse stimmen mit unserer Beobachtung bei WT-Tieren überein (Abb. 1d) und belegen, dass Herzabschnitte, die mit Vorhöfen und/oder Gefäßen angereichert sind, im Laufe der Zeit anfälliger für anhaltende Infektionen sind. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass die Erkennung durch MAVS für die Beseitigung einer CHIKV-Infektion aus Herzgewebe erforderlich ist.

Bemerkenswert ist, dass wir herausfanden, dass Mavs-/−-infizierte Herzen im Vergleich zu WT ähnliche Mengen an Isg15-mRNA induzierten (Abb. 4g). Aufgrund dieses Ergebnisses haben wir die lokale (Herzgewebehomogenat) und systemische (Serum) Produktion von IFNα oder IFNβ bei 24 hpi gemessen, was dem Höhepunkt der Induktion von Isg15 im Herzgewebe entspricht (Abb. 4g). Wir fanden heraus, dass die lokale IFN-I-Produktion im Herzgewebe zwar gering ist (Abb. 4h), aber sowohl WT- als auch Mavs-/−-Mäuse signifikante systemische Mengen an IFNα und IFNβ produzieren (Abb. 4i). Überraschenderweise waren die systemischen Spiegel von IFNα und IFNβ bei Mavs-/−-Mäusen höher als bei WT-Mäusen (Abb. 4i), was mit der deutlich höheren Viruslast korreliert, die bei Mavs-/−-Mäusen beobachtet wurde (Abb. 4b und 4d, e). . Diese Daten legen nahe, dass die Verzögerung der CHIKV-Clearance nicht vollständig durch eine verringerte IFN-I-Induktion im Zusammenhang mit Mavs–/– erklärt werden kann.

Als nächstes wollten wir herausfinden, ob die Persistenz einer CHIKV-Herzinfektion bei Mavs−/− Mäusen zu einer Schädigung des Herzgewebes führen kann. Wir infizierten Mavs−/−-, Mavs+/-- und WT-Mäuse intravenös mit CHIKV und entnahmen das Herz für die histopathologische Analyse bei 10 dpi (Abb. 5a, oberes Feld). Wie erwartet konnten wir weder bei Mavs+/- noch bei WT-Mäusen Anzeichen einer Entzündung im Myokardgewebe beobachten (Abb. 5a, b und ergänzende Daten 1). Allerdings entwickelten 53 % der CHIKV-infizierten Mavs–/– Mäuse (7 von 13 Mäusen) eine fokale Myokarditis bei 10 dpi (Abb. 5a–b und ergänzende Daten 1). Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass alle mit CHIKV infizierten Mavs-/−-Mäuse (13 von 13) eine transmurale Entzündung der Gefäßwand in den großen Gefäßen aufwiesen, die an der Basis des Herzens befestigt sind (z. B. Aorta, Lungenarterie). Vaskulitis großer Gefäße (Abb. 5a, c und ergänzende Daten 1). Bemerkenswert ist, dass ein Teil der WT- und Mavs+/–-Mäuse minimale Anzeichen einer Entzündung in den Gefäßen zeigten, die einer Endothelialitis entsprachen, die durch eine leichte Entzündung der Intimaschicht des Gefäßes gekennzeichnet war (Abb. 5a, unteres Feld). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das Fortbestehen einer CHIKV-Infektion im Herzgewebe zu entzündlichen Infiltraten führen kann, die zu fokaler Myokarditis und Vaskulitis großer Gefäße führen können.

a Oberes Feld: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Unteres Feld: Repräsentative H&E von mindestens vier unabhängigen Mäusen, die CHIKV-infizierte WT-, Mavs+/−- und Mavs−/−-Herzen bei 10 dpi zeigen. Maßstab = 200 μm. Das schwarze Quadrat zeigt den ausgewählten Abschnitt an (Einschub i und ii). Einschub i: Myokardregion. Einschub II: Große Gefäße an der Basis des Herzens. Maßstab = 20 μm. b Quantifizierung der Anzahl der Mäuse mit positiven Anzeichen einer Myokarditis. Die Daten stellen den Prozentsatz der Mäuse mit Anzeichen einer Myokarditis an der Gesamtzahl der analysierten Mäuse dar. WT (n = 4), Mavs+/− (n = 6) und Mavs−/− (n = 13). c Quantifizierung der Anzahl von Mäusen mit Vaskulitis großer Gefäße. Die Daten stellen den Prozentsatz der Mäuse mit Anzeichen einer Vaskulitis an der Gesamtzahl der analysierten Mäuse dar. WT (n = 4), Mavs+/− (n = 6) und Mavs−/− (n = 13). Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt (bezogen auf Zusatzdaten 1).

Angesichts der fokalen Myokarditis und der Vaskulitis großer Gefäße, die bei 10 dpi bei Mavs-/−-Mäusen beobachtet wurden, fragten wir, ob diese Infiltration zu einer chronischen Entzündung führen kann, die möglicherweise zu langfristigen Gewebeschäden führt. Zu diesem Zweck wurden Mavs-/−-Mäuse intravenös oder subkutan mit CHIKV infiziert und Herzgewebe wurde zur histopathologischen Analyse 2 Wochen, 1 Monat oder 2 Monate nach der Infektion entnommen. Das Gewebe wurde mit H&E gefärbt und mononukleäre Zellinfiltrate wurden von IHC auf CD3- und CD11b-Marker untersucht. Wir fanden heraus, dass ein Teil der Mavs-/−-Mäuse bei Mäusen, die entweder über intravenöse oder subkutane Inokulationswege infiziert wurden, eine fokale und multifokale Myokarditis entwickelte, die um die Gefäße herum akzentuiert war (Abb. 6a, b und ergänzende Daten 1). Diese Entzündungsherde waren durch CD11b+- und CD3+-Zellinfiltrate gekennzeichnet und hielten bei intravenös bzw. subkutan infizierten Mäusen bis zu 60 dpi bzw. bis zu 31 dpi an (Abb. 6b und ergänzende Abb. 6a, b, e). Interessanterweise konnten wir keine Veränderungen im Serumspiegel von kardialem Troponin T feststellen (Abb. 6c), was darauf hindeutet, dass trotz Myokarditis in diesem Modell keine signifikante Schädigung der Herzmuskelzellen vorliegt. Bemerkenswerterweise wurde eine durch transmurale CD3+- und CD11b+-Infiltrate gekennzeichnete Vaskulitis großer Gefäße bei infizierten Mavs-/−-Mäusen unabhängig vom Inokulationsweg bis zu 60 dpi nachgewiesen (Abb. 6d; ergänzende Abb. 6c, d und ergänzende Daten 1).

a Oberes Feld: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Unteres Feld: Repräsentative H&E-Schnitte von mindestens drei unabhängigen Mäusen, die das Myokard von subkutan oder intravenös inokulierten CHIKV-infizierten Mavs-/-Mäusen 2 Wochen, 1 Monat oder 2 Monate nach der Infektion zeigen. Gefäße innerhalb der Myokardregion werden angezeigt. Maßstab = 20 μm. b Quantifizierung der Anzahl von Mäusen mit positiven Anzeichen einer Myokarditis sowohl für intravenöse als auch für subkutane Inokulationswege. Die Daten stellen den Prozentsatz der Mäuse mit Anzeichen einer Myokarditis an der Gesamtzahl der analysierten Mäuse dar. Intravenös: PBS/HI-Kontrolle (n = 4), 14/15 dpi (n = 10), 30 dpi (n = 5) und 60 dpi (n = 4). Subkutan: PBS/HI-Kontrolle (n = 2), 14 dpi (n = 3), 31 dpi (n = 3) und 60 dpi (n = 3). C. Serumspiegel von kardialem Troponin-T, gemessen mittels ELISA PBS/HI-Kontrolle (n = 7), 2 dpi (n = 8), 5 dpi (n = 8), 7 dpi (n = 8), 10 dpi (n = 5) und 15 dpi (n = 4). D. Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Linkes Feld: Quantifizierung der Anzahl von Mäusen mit Vaskulitis großer Gefäße. Die Daten stellen den Prozentsatz der Mäuse mit Anzeichen einer Vaskulitis an der Gesamtzahl der analysierten Mäuse dar. HI-Kontrolle (n = 3). Intravenös: 15 dpi (n = 6), 30 dpi (n = 4) und 60 dpi (n = 4). Subkutan: 14 dpi (n = 3), 31 dpi (n = 3) und 60 dpi (n = 3). Rechtes Feld: repräsentative H&E- und CD3/CD11b-IHC-Schnitte von mindestens drei unabhängigen Mäusen, die Gefäße zeigen, die an der Herzbasis von subkutan oder intravenös inokulierten CHIKV-infizierten Mavs-/-Mäusen 2 Wochen und 2 Monate nach der Infektion befestigt sind. Maßstab = 20 μm. Boxplots zeigen Median- und Quartilbereiche, Whisker stellen den Bereich dar (c). Die P-Werte wurden mithilfe von Kruskal-Wallis und Dunns Mehrfachvergleichstest (c) berechnet. Erstellt mit BioRender.com. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Bezogen auf Zusatzdaten 1 und Zusatzabbildung 6.

Bemerkenswert ist, dass das Herzgewebe einer infizierten Mavs-/−-Mäuse, die einer CHIKV-Infektion bei 15 dpi erlag (Ergänzungstabelle 1), erhebliche Gewebeschäden aufwies, die durch eine fleckige dystrophische Verkalkung der Myozyten, die einzelne Myozyten betraf, und eine fokale Myokarditis, die durch entzündliche Infiltrate von CD11b+ entstand, gekennzeichnet waren und CD3+-Zellen, ohne Anzeichen einer Fibrose (ergänzende Abbildung 7). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das Fortbestehen einer CHIKV-Infektion im Herzgewebe zu chronischen Entzündungen führt, die durch fokale oder multifokale Myokarditis und Vaskulitis großer Gefäße gekennzeichnet sind.

In dieser Studie haben wir Mechanismen definiert, die an einer CHIKV-Herzgewebeinfektion beteiligt sind, und Wirtsfaktoren identifiziert, die an der Entwicklung von Herzgewebeschäden beteiligt sind. Hier haben wir gezeigt: (i) dass Herzfibroblasten ein direktes Ziel einer CHIKV-Infektion in einem immunkompetenten Wirt sind; (ii) dass Herzgewebe eine lokale IFN-I-Reaktion auslöst, die für die CHIKV-Beseitigung und die Verhinderung von Gewebeschäden erforderlich ist; (iii) dass CHIKV bei fehlender MAVS-Signalübertragung in infizierten Herzen bestehen bleibt und (iv) dass das Versäumnis, CHIKV bei Mavs-/−-Mäusen zu beseitigen, zu fokaler Myokarditis und chronischer Vaskulitis großer Gefäße führt, die bis zu 60 dpi nachweisbar sind.

Frühere Studien, einschließlich unserer eigenen, berichteten über das Vorhandensein infektiöser Partikel oder viraler RNA im nicht durchbluteten Herzgewebe von CHIKV-infizierten Mäusen19,20. Aufgrund der mangelnden Durchblutung und der hohen Konzentrationen an CHIKV im Blutkreislauf blieb jedoch unklar, ob Herzgewebe ein direktes Ziel einer CHIKV-Infektion ist. Hier haben wir durch die Einbeziehung eines Perfusionsschritts und die Verwendung orthogonaler experimenteller Ansätze gezeigt, dass sich CHIKV unabhängig vom Infektionsweg aktiv im Herzgewebe immunkompetenter Mäuse repliziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass CHIKV Herzfibroblasten infiziert und dass seine Infektion einem diskreten und fokalen Muster in Ventrikeln, Vorhöfen, Klappen und der perivaskulären Region folgt. Wir fanden heraus, dass primäre menschliche Herzfibroblasten anfällig und tolerant für CHIKV sind. Tatsächlich wurde das CHIKV-Antigen in Herzfibroblasten bereits zuvor in menschlichen Autopsien von Personen identifiziert, die an CHIKV12 gestorben waren. Daher stimmen unsere Ergebnisse in Mausmodellen mit dem Tropismus überein, der bei menschlichen Autopsien beobachtet wurde.

Wir haben gezeigt, dass CHIKV bei WT-Mäusen innerhalb der ersten Woche nach der Infektion aus dem Herzgewebe entfernt wird, ohne Gewebeschäden zu verursachen. Unsere RNA-seq-Daten zeigten, dass infiziertes Herzgewebe eine Hochregulierung der angeborenen Immunität, der adaptiven Immunität und der IFN-I-Signalwege aufweist, ähnlich wie es für mit CHIKV infiziertes Fußballen- und Lymphknotengewebe beschrieben wurde38. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass Gene, die zuvor mit dem Schutz des Herzgewebes und dem antioxidativen Stoffwechsel in Verbindung gebracht wurden (Apod, Aft5, Fgf21 und Mthfd2), bei 2 dpi hochreguliert waren39,40. Apod ist ein kardioprotektives Gen, dessen Expression im Herzen von Mäusen während eines Myokardinfarkts induziert wird und von dem angenommen wird, dass es das Herz vor ischämischen Schäden schützt28. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Apod das am stärksten hochregulierte Gen in SARS-CoV-2-infiziertem Herzgewebe bei tödlichen COVID-19-Fällen ist41 und es wurde festgestellt, dass es während einer Coxsackievirus-B3-Infektion in einer Gruppe von Herzfibroblasten hochreguliert war42. Weitere Studien sind erforderlich, um die spezifische Rolle von Apod beim Herzschutz während einer CHIKV-Infektion zu bestimmen.

Interessanterweise beobachteten wir unter Verwendung der KEGG-Datensätze eine Hochregulierung des viralen Myokarditis-Wegs und eine Herunterregulierung des Kontraktilitätswegs des Herzgewebes bei 5 dpi (ergänzende Abbildung 3c, g – i; ergänzende Tabelle 4). Allerdings haben wir histopathologisch keine Anzeichen einer Herzgewebeschädigung beobachtet (Supplementary Data 1), was darauf hindeutet, dass eine CHIKV-Infektion Transkriptionsprogramme auslöst, die an einer Herzfunktionsstörung beteiligt sind und nicht ausreichen, um zu offensichtlichen Phänotypen einer Herzschädigung zu führen.

Wir fanden heraus, dass CHIKV-infizierte Herzen eine signifikante, aber vorübergehende Produktion von proinflammatorischen Chemokinen und Zytokinen sowie eine Induktion von IFITM3- und ISG15-Proteinen sowohl in CHIKV-infizierten als auch in nicht infizierten Vimentin+-Herzzellen aufweisen. Interessanterweise wurde gezeigt, dass menschliche Herzfibroblasten bei Stimulation durch TLRs oder RIG-I-ähnliche Rezeptoren proinflammatorische Zytokine produzieren und eine antivirale Immunantwort auslösen können43. Unsere Studie bestätigt die entscheidende Rolle der IFN-I-Signalübertragung bei der Kontrolle der CHIKV-Infektion in menschlichen Herzfibroblasten. Im Kontext eines immunkompetenten Wirts zeigt das infizierte Herzgewebe eine robuste und lokale IFN-I-Reaktion, die die CHIKV-Infektion innerhalb weniger Tage mit geringer bis gar keiner Herzschädigung behebt. Diese Beobachtung liefert eine Erklärung dafür, warum die CHIKV-Herzmanifestation bei CHIKV-infizierten Personen kein allgegenwärtiges Ergebnis darstellt.

Dementsprechend ergab ein Bericht, bei dem 12 Tage alte KO-Mäuse für ein Protein verwendet wurden, das an der Produktion von IFN-β während einer CHIKV-Infektion beteiligt ist (GADD34), im Vergleich zu WT21 einen signifikanten Anstieg der Viruspartikel im Herzen und die Entwicklung einer Myokarditis. Ähnliche Ergebnisse wurden für IFITM3 KO-Mäuse während einer Influenzavirus-Infektion beschrieben44. Daher könnte das Risiko kardialer Komplikationen bei CHIKV-infizierten Patienten mit genetischen und nicht genetischen Faktoren (wie Koinfektionen, Ernährung usw.) verbunden sein, die zu einer verminderten IFN-I-Reaktion führen. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in TLR3, die bei Patienten mit enteroviraler Myokarditis gefunden wurden, sind mit einer verminderten TLR3-vermittelten Signalübertragung verbunden und zeigten eine beeinträchtigte IFN-I-Reaktion nach einer Coxsackievirus-B3-Infektion45. Somit könnten SNPs in IFN-I und Gene, die an der MAVS-Signalübertragung beteiligt sind, einer erhöhten Anfälligkeit für Herzkomplikationen bei CHIKV-infizierten Patienten zugrunde liegen. SNPs in der kodierenden Region des menschlichen MAVS-Gens können zu Funktionsstörungen führen46,47. Darüber hinaus deuten neuere Studien auf einen Zusammenhang zwischen Alter und verminderter Wahrnehmung durch MAVS48 hin, was ein Faktor sein könnte, der zur beobachteten Korrelation zwischen Alter und CHIKV-Schweregrad beiträgt5,15. Weitere Arbeiten sollten sich darauf konzentrieren, festzustellen, ob die Variabilität der IFN-I- und MAVS-Signalübertragung zwischen Einzelpersonen die unterschiedliche Anfälligkeit für CHIKV-induzierte Herzkomplikationen erklären kann.

An der In-vivo-Kontrolle einer CHIKV-Infektion sind mehrere PRRs beteiligt30. Hier zeigen wir, dass die CHIKV-Clearance aus infiziertem Herzgewebe MAVS-abhängig, aber unabhängig von MYD88, TRIF oder dem NLRP3-Inflammasom ist. Allerdings fanden wir im Vergleich zu WT eine geringere Anzahl infektiöser Partikel, die aus infizierten Herzen von Casp1/11−/−- und Myd88−/−-Mäusen isoliert wurden, was darauf hindeutet, dass das NLRP3-Inflammasom sowie die Signalübertragung durch TLR7 in den frühen Schritten von eine Rolle spielen könnten CHIKV-Herzinfektion. Wir zeigen, dass CHIKV in Abwesenheit von MAVS im Herzgewebe persistiert. Interessanterweise waren die systemischen Spiegel von IFNα und IFNβ bei Mavs−/−-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant höher und korrelierten direkt mit der bei Mavs−/− beobachteten Viruslast. Mehrere PRRs sind an der IFN-I-Produktion und dem Schutz im Zusammenhang mit einer Alphavirus-Infektion beteiligt31,49, was darauf hindeutet, dass andere PRRs wie TLR3 oder TLR7 in diesem Modell zur Rettung der systemischen IFN-I-Produktion beitragen könnten50. In Übereinstimmung damit stellten wir fest, dass infizierte Herzen in Mavs-/−-Mäusen im Vergleich zu WT ähnliche Werte an lokalem Isg15 aufweisen, was darauf hindeutet, dass Herzgewebe auf IFN-I reagiert, wenn kein MAVS-Signal vorhanden ist. Diese faszinierenden Ergebnisse legen nahe, dass die CHIKV-Clearance aus Herzgewebe bei Mavs-/−-Mäusen nicht ausschließlich von einer mangelhaften lokalen IFN-I-Produktion abhängt. Eine anhaltende CHIKV-Infektion im Herzgewebe könnte mit den Auswirkungen anderer Mediatoren stromabwärts von MAVS, wie dem NFKβ-Signalweg, verbunden sein51. Darüber hinaus ist es möglich, dass der Beitrag des MAVS-Signals zur Beseitigung der CHIKV-Infektion aus dem Herzgewebe mit späten Schritten der Virusinfektion zusammenhängt, die möglicherweise auftreten, nachdem die systemische IFN-I-Reaktion vernachlässigbare Werte erreicht hat. Zur Unterstützung dieser Beobachtung beobachten wir eine positive Steigung beim Nachweis von CHIKV-Genomen zwischen 2 und 10 dpi (Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass die aktive Virusreplikation in Mavs −/− im Vergleich zu WT eine andere Kinetik aufweist. Zukünftige Studien werden sich auf die Bestimmung der Mechanismen konzentrieren, die an der Wechselwirkung zwischen MAVS-Signalisierung und CHIKV-Viruspersistenz im Herz-Kreislauf-Gewebe beteiligt sind. Es ist wichtig anzumerken, dass eine andere mögliche Erklärung für unsere Ergebnisse teilweise mit dem Umfang unserer Studie zusammenhängen könnte. Die Massenanalyse bietet keine Lösung, um lokale Effekte zu definieren, die mit Mavs-/−-spezifischen Reaktionen verbunden sind. Ein Beispiel für Letzteres wurde bei mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus infizierten Gehirnen beobachtet, bei denen durch Massen-RNA-seq52 keine Unterschiede in der globalen Induktion der IFN-I-Signalisierung zwischen Mavs–/– und WT beobachtet wurden, diese jedoch bei der Analyse deutlich wurden bei Einzelzellenauflösung52. Einzelzelltechnologien wurden kürzlich zur Untersuchung von Herzgewebe und viraler Myokarditis eingesetzt42. Daher können Studien an CHIKV-infiziertem Herzgewebe auf Einzelzellebene dazu beitragen, die Rolle der lokalen zellulären Effekte bei der CHIKV-Clearance aufzuklären.

Mavs–/– Mäuse zeigen unterschiedliche Anfälligkeiten gegenüber verwandten arthritogenen Alphaviren30,53. Während mit dem Ross-River-Virus infizierte Mavs−/−-Mäuse eine schwere Erkrankung entwickelten und nach 8 dpi der Infektion erlagen53, überlebten CHIKV-infizierte Mäuse bei subkutaner Inokulation30 (Ergänzungstabelle 1). Vergleichsstudien, die sich mit der Rolle von PRR bei der Kontrolle der Infektion mit verwandten arthritogenen Alphaviren befassen, wären von grundlegender Bedeutung für die Erweiterung unseres Wissens über virusspezifische Mechanismen der Pathogenese.

Wir haben gezeigt, dass eine CHIKV-Infektion bei Mavs−/− Mäusen zu fokaler und multifokaler Myokarditis führte. Dennoch blieben die Serumspiegel von cTnT unverändert, was das Fehlen einer Herzmuskelschädigung belegt. Wir fanden heraus, dass CHIKV keine Herzmuskelzellen bei Mäusen infiziert, was mit dem Fehlen von Hinweisen auf eine Herzmuskelzelleninfektion in postmortalen menschlichen Herzgewebeproben übereinstimmt12. Bei Personen mit CHIKV-assoziierten kardialen Manifestationen wurden jedoch erhöhte kardiale Troponine beobachtet6,7,13,16, was die Möglichkeit erhöht, dass CHIKV unter bestimmten Bedingungen eine Schädigung der Herzmuskelzellen hervorrufen kann. Eine weitere Alternative besteht darin, dass Herzmuskelzellen von Menschen und Mäusen unterschiedlich anfällig für eine CHIKV-Infektion sind. Weitere Studien mit menschlichen Herzgewebeexplantaten oder menschlichen Kardiomyozyten-Organoiden sind erforderlich, um die relative Anfälligkeit menschlicher Herzmuskelzellen gegenüber einer CHIKV-Infektion zu bewerten.

Schließlich fanden wir heraus, dass eine CHIKV-Infektion zu einer chronischen Gefäßentzündung in großen Gefäßen an der Herzbasis führte. Diese chronische Entzündung im Gefäßsystem ist faszinierend und macht das Gefäßsystem selbst als potenzielle Nische für eine CHIKV-Infektion deutlich. Tatsächlich haben wir ein unterschiedliches Verhalten bei der CHIKV-Anfälligkeit zwischen dem oberen und dem unteren Abschnitt des Herzens festgestellt, und eine aktive CHIKV-Replikation wurde in Zellen innerhalb von Gefäßen mit bis zu 10 dpi in Mavs–/– festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine anhaltende Infektion im Herzgewebe zu einer Herzentzündung und möglicherweise zu einer Schädigung des Herzgewebes führt, und verdeutlichen ein potenzielles Risiko für die Entwicklung langfristiger Gefäßschäden im Zusammenhang mit einer CHIKV-Infektion.

Insgesamt zeigt diese Studie den direkten Kausalzusammenhang zwischen der aktiven CHIKV-Replikation im Herzen und der Entwicklung kardiovaskulärer Manifestationen. Zukünftige Studien, die sich auf atypische Manifestationen arboviraler Erkrankungen und deren Pathogenese konzentrieren, sind von grundlegender Bedeutung für das Verständnis des gesamten Spektrums der Folgen dieser Infektionen. Dieses Wissen ist für die Überwachung atypischer Manifestationen in Endemiegebieten sowie bei zukünftigen Epidemien von größter Bedeutung. Dies könnte wiederum für die Frühdiagnose, Prävention und therapeutische Interventionen genutzt werden, insbesondere in Endemiegebieten, in denen die Verbreitung dieser Viren eine Belastung für die öffentliche Gesundheit darstellt54,55. Insgesamt bieten wir hier mechanistische Einblicke, wie CHIKV zu Herzschäden führen kann, unterstreichen die Bedeutung der Überwachung der Herzfunktion bei Patienten mit CHIKV-Infektionen und legen den Grundstein für die Entwicklung neuer Ansätze zur Verhinderung virusbedingter Herzkomplikationen.

Die Arbeit mit CHIKV wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) an der NYU Grossman School of Medicine durchgeführt.

Die Zellen wurden bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten. Babyhamsternieren (BHK-21, ATCC CCL-10) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Corning), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Atlanta Biologicals) und 1 % nichtessentieller Aminosäuren (NEAA, Gibco), gezüchtet. Verozellen (ATCC CCL-81) wurden in DMEM mit 10 % neugeborenem Kälberserum (NBCS; Gibco) gezüchtet. Menschliche primäre Herzzellen wurden von PromoCell bezogen, bis zur Passage 10 verwendet und gemäß den Empfehlungen des Unternehmens gezüchtet. Menschliche Herzfibroblasten (C-12375), menschliche kardiale mikrovaskuläre Endothelzellen (C-12285) und menschliche Herzmuskelzellen (C-12810) wurden in Fibroblasten-Wachstumsmedium 3 (PromoCell, C-23025), Endothelzell-Wachstumsmedium MV ( PromoCell, C-22020) und Myozyten-Wachstumsmedium (PromoCell, C-22070), ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin (Cellgro, 30-002-CI). Alle Zelltypen wurden mit dem Lookout Mycoplasma PCR-Nachweiskit (Sigma-Aldrich) als frei von Mykoplasmen bestätigt.

Infektiöse Klone von CHIKV (CHIKV-Stamm 06-049; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM258994) und CHIKV-Reporter (CHIKV-ZsGreen; CHIKV-Stamm 06-049) wurden wie zuvor beschrieben erzeugt20,56. Virenrettung aus infektiösen Klonen. Kurz gesagt, 10 μg jedes Infektionsklonplasmids wurden über Nacht mit NotI (Thermo-Scientific) bei 37 °C linearisiert, mit Phenol:Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in nukleasefreiem Wasser bei 1 μg/μl resuspendiert. In vitro transkribierte virale RNAs wurden unter Verwendung des SP6 mMESSAGE mMACHINE-Kits (Ambion) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Nach der RNA-Synthese wurden die Proben mit DNAse behandelt und die RNAs durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und in nukleasefreiem Wasser bei einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert. Die RNA-Integrität wurde durch Gelelektrophorese (1 % Agarose) bestätigt. Die RNA wurde aliquotiert und bis zur Elektroporation bei –80 ° C gelagert. Infektiöse Viren wurden durch Elektroporation von BHK-Zellen mit in vitro transkribierten viralen RNAs hergestellt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen trypsinisiert, zweimal mit eiskaltem DPBS (Corning) gewaschen und bei 1 × 107 Zellen/ml in PBS resuspendiert. 390 μl Zellen wurden mit 10 μg in vitro transkribierter RNA gemischt und in eine 2 mm Elektroporationsküvette (BioRad) gegeben. BHK-21-Zellen wurden mit einem Impuls bei 1,2 kV, 25 μF und unendlichem Widerstand elektroporiert. Den Zellen wurde erlaubt, sich 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) zu erholen, sie wurden in 6 ml warmes DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % NEAA, überführt und 72 Stunden lang bei 37 °C in einen T25-Kolben gegeben. Das Virus wurde geerntet, 5 Minuten lang bei 1200 × g geklärt und 3 ml der geklärten Überstände wurden zur Infektion des T175-Kolbens verwendet, um Arbeitsvorräte zu erzeugen (Passage 1). Die Virustiter wurden durch Plaque-Assay in Vero-Zellen bestimmt. Um hitzeinaktiviertes Virus (HI) zu erzeugen, wurden Virusvorräte mit Titern von 106 PFU/ml 4 Stunden lang in einem Wasserbad bei 56 °C inkubiert. Virustiter und Verlust der Infektiosität des HI-Virus wurden durch Plaque-Assay auf Vero-Zellen bestätigt (siehe unten).

Zehnfache Verdünnungen jedes Virus in DMEM wurden 1 Stunde lang bei 37 °C zu einer Monoschicht aus Vero-Zellen gegeben. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 0,8 % Agarose in DMEM mit 2 % NCBS überschichtet und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden mit 4 % Formalin fixiert, der Agarosepfropfen entfernt und die Plaques durch Kristallviolettfärbung sichtbar gemacht. Die Titer wurden durch Zählen der Plaques in der höchsten zählbaren Verdünnung bestimmt.

Menschliche primäre Herzzellen wurden in flache transparente schwarze Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, 07200588) mit einer Dichte von 18.000 Zellen/Vertiefung ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen wie folgt behandelt: (i) In-vitro-Poly(I:C)-Stimulation, (ii) Ruxolitinib-Behandlung oder (iii) Scheinbehandlung. Zur Poly(I:C)-Stimulation wurden menschliche Herzfibroblasten in einer 96-Well-Platte mit 62 ng hochmolekularem Poly(I:C) (InvivoGen) unter Verwendung des TransIT-mRNA Transfection Kit (Mirus Bio) transfiziert oder mit TransIT behandelt Transfektion allein (Trägerkontrolle). Nach 2 Stunden wurden die Zellen gewaschen und für nachfolgende Experimente verwendet. Für den Ruxolitinib-Zustand wurden die Zellen mit 5 μM Ruxolitinib (Invitrogen, INCB018424) vorbehandelt oder 3 Stunden lang scheinbehandelt, die Zellen wurden gewaschen und für nachgelagerte Experimente verwendet. Mit Poly(I:C), Ruxolitinib vorbehandelte oder scheinbehandelte Zellen wurden dann mit CHIKV-ZsGreen bei einer MOI von 0,25 infiziert oder 1 Stunde lang bei 37 °C mit DMEM scheininfiziert. Nach 1 Stunde wurde das Inokulum entfernt, die Monoschichten einmal mit kaltem PBS gewaschen und 100 μl Fibroblast Growth Medium 3 (PromoCell, C-23025) zu den Zellen gegeben. Für den Ruxolitinib-Zustand wurde den Zellen Fibroblasten-Wachstumsmedium 3 mit 5 μM Ruxolitinib zugesetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 10 % Formalin fixiert und für die Mikroskopie gefärbt (siehe unten).

Menschliche primäre Herzzellen wurden in flachen, transparenten schwarzen Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, 07200588) in einer Dichte von 18.000 Zellen/Vertiefung ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 24 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen von IFNα A/D (Millipore Sigma, #I4401) oder IFNβ (Millipore Sigma, #IF014) stimuliert. Mit IFN vorbehandelte oder scheinbehandelte Zellen wurden mit CHIKV-ZsGreen bei einer MOI von 0,25 infiziert oder 1 Stunde lang bei 37 °C mit DMEM scheininfiziert. Nach 1 Stunde wurde das Inokulum entfernt, die Monoschichten einmal mit kaltem PBS gewaschen und 100 μl Fibroblast Growth Medium 3 (PromoCell, C-23025) zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 10 % Formalin fixiert und für die Mikroskopie gefärbt (siehe unten).

Nach der Fixierung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, mit 0,1 % Triton-X/PBS (Fisher, 9002-93-1) 10 Minuten lang permeabilisiert und erneut mit PBS gewaschen. Für rekombinante IFN-I-Vorbehandlungsexperimente wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI (Thermo) in einer Verdünnung von 1:1000 gefärbt und dreimal mit PBS gewaschen. Für In-vitro-Reaktionsexperimente wurden die Zellen über Nacht in 1 % BSA/PBS bei 4 °C blockiert. Die Zellen wurden mit Anti-ISG15-Antikörper (ProteinTech, 15981-1-AP) in einer Verdünnung von 1:100 in 0,1 % BSA/PBS 1 Stunde lang bei 37 °C gefärbt und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit sekundärem AF555-Anti-Kaninchen-Antikörper (Invitrogen) und DAPI (Thermo) in einer Verdünnung von 1:1000 1 Stunde lang bei 37 °C gefärbt und dreimal mit PBS gewaschen. Die Platten wurden mit der CellInsight CX7 High-Content Screening Platform (Thermofisher) belichtet, wobei das 4×-Objektiv in 9 Feldern jede Vertiefung der 96-Well-Platte vollständig abdeckte. Die High-Content-Software wurde für die Mikroskopie und Bildanalyse verwendet.

Eier von Aedes (Ae.) albopictus aus der Kläranlage Tallman Island in Queens, New York City, wurden vom New Yorker Gesundheitsministerium57 gesammelt. Die Mücken wurden in Memmert-Feuchtkammern bei 28 °C, 70 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Lichtzyklus pro Tag aufgezogen und gehalten. Alle Übertragungsstudien wurden mit Mücken der Generation F7 durchgeführt. Mückeninfektion. Ae. Albopictus-Mücken aus Tallman (F7) wurden einer künstlichen Blutmahlzeit ausgesetzt, die 1E6 PFU/ml CHIKV enthielt. Kurz gesagt, die Viren wurden 1:2 mit PBS-gewaschenem Schafsblut (Fisher Scientific), ergänzt mit 5 mM ATP, gemischt. Als nicht infizierte Kontrollen dienten Mücken, die nicht infektiösen Blutmahlzeiten ausgesetzt waren. Weibliche Mücken durften sich 60–90 Minuten lang durch eine künstliche Membran von 37 °C warmen Blutmahlzeiten ernähren. Vollgestopfte Weibchen wurden identifiziert, sortiert und 7 Tage lang bei 28 °C mit 10 % Saccharose ad libitum inkubiert. Vor der Übertragung wurde den Mücken 12 Stunden lang die Nahrung entzogen.

Die Mäuse wurden bei 21–23 °C, 30–70 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus in einer pathogenfreien Einrichtung an der NYU Grossman School of Medicine gehalten. Die Luftwechselraten in Wohnräumen sind auf 10–15 Luftwechsel pro Stunde festgelegt. Mäuse werden nach Belieben mit Futter und Wasser versorgt. Alle Mäuse werden in autoklavierten, individuell belüfteten Käfigen (Tecniplast, West Chester, PA) mit stündlichem Luftwechsel von 50–70 Käfigvolumen gehalten. Versuchstiere wurden in Gruppen von bis zu 5 Mäusen pro Käfig gehalten. Zu den Mäusen, die im Haus gezüchtet und gezüchtet und in derselben Einrichtung unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten wurden, gehörten die folgenden Stämme: C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse (000664, Jackson Laboratories). C57BL/6(027) Wildtyp-Mäuse (Charles River Laboratories), Ifnar1–/– (028288, Jackson Laboratories); Myd88−/− (009088, Jackson Laboratories); Casp1/11−/− (016621, Jackson Laboratories); Mavs−/− (008634, Jackson Laboratories), Trif Lps2/Lps2 (005037, Jackson Laboratories). Alle Mäuse wurden als Heterozygoten gezüchtet, um WT- und KO-Wurfgeschwisterkontrollen zu erzeugen, und nachfolgende WT- oder KO-Kolonien aus Wurfgeschwisterkontrollen wurden für Experimente verwendet.

Tierversuche wurden in der Einrichtung der Tierbiosicherheitsstufe 3 (ABSL3) der NYU Grossmann School of Medicine in Übereinstimmung mit allen Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der NYU Grossman School of Medicine und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of durchgeführt Gesundheit, das Tierschutzgesetz und das US-Bundesgesetz. Die Studie erhielt von der NYU Grossman School of Medicine (IACUC) gemäß dem IACUC-Protokoll Nr. IA16-01783 eine ethische Genehmigung. In allen Experimenten wurden Versuchstiere beiderlei Geschlechts verwendet, mit Ausnahme der Bulk-RNA-seq-Experimente, bei denen wir männliche Mäuse verwendeten. Für die Massen-RNA-Seq verwendeten wir männliche Mäuse, um potenzielle Batch-Effekte aufgrund von Geschlechtsunterschieden zu minimieren. Die Infektionen erfolgten entweder durch subkutane Impfung, Mückenstich oder intravenöse Injektion über Schwanzveneninjektionen. Kurz gesagt, 6–8 Wochen alte Männer und Frauen wurden mit 1E5 PFU von CHIKV, CHIKV-ZsGreen infiziert oder mit Träger (PBS oder DMEM) oder einem ähnlichen Inokulum eines hitzeinaktivierten Virus (HI) scheininfiziert. Zur subkutanen Inokulation wurden Mäuse durch Inhalation von Isofluran (Henry Schein Animal Health) anästhesiert und ihnen wurden 50 μl Virus oder Kontrolle in den linken hinteren Fußballen injiziert. Zur intravenösen Inokulation wurden die Mäuse zurückgehalten und ihnen wurden über die Schwanzveneninjektion 100–200 μl Virus oder Kontrollinokulum mit einer 29-G-Insulinspritze (Fisher Scientific) injiziert. Zur natürlichen Übertragung wurden Mäuse über einem mit einem Netz bedeckten Pint-Becher mit 4–8 CHIKV-infizierten oder nicht infizierten (nur Blut) Mücken immobilisiert, und die Mücken durften 40 Minuten lang fressen. Anschließend wurden die Mäuse in ihre Käfige zurückgebracht, die Mücken getötet und homogenisiert und die Virustiter der infizierten Mücken mittels Plaque-Assay bestimmt. Infizierte Versuchsmäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Durch Herzpunktion wurde Blut gesammelt und die Mäuse wurden sofort zur transkardialen Perfusion präpariert. Mäuse wurden mit 30 ml kaltem PBS mit einer 21–23 G-Nadel perfundiert. Die Qualität der Herzdurchblutung wurde durch Bestätigung der vollständigen Blutentfernung in Leber und Nieren beurteilt. Dann wurden die Herzen extrahiert und in eine 12-Well-Platte mit 1 ml PBS gegeben. Jedes Herz wurde in vier Kammern geöffnet und als frei von Blutgerinnseln bestätigt. Alle Mäuse in dieser Studie wurden perfundiert, mit Ausnahme derjenigen, die für die Histopathologie und Immunfärbung verwendet wurden. Herz, Wadenmuskel und Bauchspeicheldrüse wurden in 500 μl PBS gesammelt, das eine (Herz und Bauchspeicheldrüse) oder zwei (Wadenmuskel) 5-mm-Edelstahlkügelchen (QIAGEN) enthielt, und mit TissueLyser II (QIAGEN) 2 Minuten lang bei 30 1/s homogenisiert (Herz und Bauchspeicheldrüse) bzw. 4 Min. (Wadenmuskel). Trümmer wurden durch 8-minütige Zentrifugation bei 6010 × g entfernt. Das Blut wurde in 1,5-ml-Röhrchen mit 20 μl 0,5 M EDTA gesammelt und 8 Minuten lang bei 6010 × g zentrifugiert. Die Virustiter wurden durch Plaque-Assay in Vero-Zellen oder TCID50 in BHK-21-Zellen quantifiziert.

Kurz gesagt, zur TCID50-Bestimmung wurden BHK-21-Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät (10.000 Zellen/Vertiefung). Für Herz-, Muskel- und Pankreasproben entspricht die anfängliche Verdünnung einer Verdünnung von 1:5 aus dem ursprünglichen Homogenat, für Serum betrug die anfängliche Verdünnung 1:20. Nach der ersten Verdünnung wurden zehnfache Verdünnungen von Gewebehomogenaten oder Serum in DMEM, ergänzt mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum (Anti-Anti, Invitrogen), hergestellt. Monoschichten wurden mit 50 μl der Verdünnungen infiziert. Nach 1 Stunde wurden 100 μl DMEM + 10 % FBS + 1 % Anti-Anti in jede Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden 96 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Platten wurden unter dem Mikroskop auf Anzeichen einer zytopathischen Wirkung (CPE) untersucht. Als Negativkontrolle wurde nicht infiziertes Gewebe verwendet, und jede Platte enthielt scheinbehandelte Vertiefungen. Positive Vertiefungen entsprechen allen Vertiefungen, die CHIKV-spezifisches CPE aufweisen. Negative Wells, entspricht jedem Well ohne CPE. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 10 % Formalin fixiert und unter dem Mikroskop sichtbar gemacht. Jede Probe wurde in 6 oder 7 technischen Replikaten gemessen und die Berechnung erfolgte mit dem Online-TCID50-Rechner (https://www.klinikum.uni-heidelberg.de).

RNA-Extraktionen wurden unter Verwendung von TRIzolTM-Reagenz (Invitrogen, 200 μl geklärtes Gewebehomogenat wurden zu 500 μl TRIzolTM hinzugefügt) gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt. Die extrahierte RNA wurde quantifiziert und auf 200 ng/μl verdünnt. Für Taqman-Assays wurde für jeden Datensatz unter Verwendung in vitro transkribierter CHIKV-RNAs wie oben beschrieben eine Standardkurve erstellt, die einen Bereich von 100 ng/μl bis 1E-6 ng/μl CHIKV-Virus-RNA abdeckt. Für die verschiedenen Gewebe haben wir die Menge der gesamten viralen RNA so optimiert, dass sie im linearen Bereich der Kalibrierungskurve liegt. Die Anzahl der genomischen (nsp4) oder subgenomischen (E1) CHIKV-RNA wurde durch RT-qPCR unter Verwendung von 0,25–1 μg Gesamt-RNA als Vorlage und dem Taqman RNA-to-CT One-Step Kit (Applied BiosystemsTM) in einer Gesamtreaktion quantifiziert Volumen von 25 μl/Well. Die folgenden Primer und Sonden wurden verwendet: CHIKV-Primer zur Amplifikation des nsP4-Fragments (CHIKV vorwärts (IOLqPCR6856F): 5′-TCACTCCCTGCTGGACTTGATAGA-3′ rückwärts (IOLqPCR6981R): 5′-TTGACGAACAGAGTTAGGAACATACC-3′) und eine Sonde (5′-(6 -Carboxyfluorescein)-AGGTACGCGCTCAAGTTCGGCG-(schwarzer Holequencher)-3′). CHIKV-Primer zur Amplifikation des E1-Fragments (CHIKV vorwärts (IOLqPCR10865F): 5ʹ-TCGACGCGCCCTCTTTAA-3ʹ); Rückseite (IOLqPCR10991R): 5ʹ-ATCGAATGCACCGCACACT-3ʹ und eine Sonde (5ʹ-/56-FAM/ACCAGCCTG/ZEN/CACCCATTCCTCAGAC/3IABkFQ/-3ʹ). Die Endkonzentration von Primer und Sonden betrug 1 μM bzw. 0,6 μM. Die reverse Transkription wurde auf dem qPCR-Gerät QuantStudio 3 unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: 30 Minuten bei 48 °C, gefolgt von 10 Minuten bei 95 °C. Die Amplifikation wurde über 40 Zyklen wie folgt durchgeführt: 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 1 Minute. Für Sybr Green-Quantifizierungen wurden die Konzentrationen von Isg15, Apod, Ccl5 und Ifitm3 in Herzhomogenaten mit SYBR Green Master Mix (Thermo) und unter Befolgung der Herstelleranweisungen auf einem QuantStudio 3 qPCR-Gerät gemessen. Kurz gesagt wurde die cDNA-Synthese an gereinigten RNA-Proben wie oben beschrieben unter Verwendung des Maxima H-Minusstrang-Kits (Thermo Scientific) und Zufallsprimern unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: 25 °C für 10 Minuten, 50 °C für 30 Minuten und 85 °C für 5 Min. Die Amplifikation wurde über 40 Zyklen wie folgt durchgeführt: 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min. Für jede Reaktion wurde die Schmelzkurve ausgewertet. Primer: Isg15 (fw:5′-GGTGTCCGTGACTAACTCCAT-3′ und rv:5′-TGGAAAGGGTAAGA CCGTCCT-3′), Apod (fw:5′-CTGGGTGGAAACTTCAGTCATCTGATCT-3′ und rv:5′-CGCCAGCGTGGCCAGGAAC-3′) , Ccl5 (fw:5'-TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3' und rv:5′-TCCTAGCTCATCTCCAAATAGTTGATG-3′), Ifitm3 (fw:5′-TTCAGTGCTGCCTTTGCTC-3′ und rv:5′-CCTTGATTCTTTCGTAGTTTGGGG-3′) und 18S (fw:5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′ und rv:5′-CCATCCAA TCGGTAGTAGCG-3′). RT-qPCR-Daten wurden mit der QuantStudio-Software v1.4 gesammelt. Die relative Expression der jeweiligen Gene zur 18S-Expression wurde unter Verwendung der ΔΔCT-Methode berechnet und die Werte wurden als fache Änderung ausgedrückt, normalisiert auf die scheininfizierte Kontrolle. ΔΔCT für jede Probe (infiziert und scheininfiziert) wurde anhand des Durchschnitts aller ΔCT-Werte berechnet, die für den Scheinzustand berechnet wurden.

Zur Massen-RNA-Sequenzierung wurden männliche C57BL/6-Mäuse intravenös mit 1E5 PFU CHIKV oder HI-Kontrolle infiziert, und die Herzen wurden mit 30 ml PBS perfundiert und bei 2 und 5 dpi gesammelt. Die Herzen wurden in 500 μl TRIzolTM (Invitrogen) mit einer 5-mm-Edelstahlperle gesammelt und wie oben beschrieben verarbeitet. Die RNA wurde mit dem Zymo Direct-Zol RNA Purification Kit (Zymo Research, Nr. R2072) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Insgesamt 500 ng pro Probe wurden zur Qualitätskontrollbewertung, automatisierten TruSeq-Strang-Gesamt-RNA mit RiboZero Gold-Bibliotheksvorbereitung und Illumina Novaseq6000-Sequenzierung (Einzelpaar 100) an das NYU Genome Technology Center geschickt. FASTQ-Dateien wurden mit einer verketteten Datei abgeglichen, die das Mausgenom (Version mm10) und das CHIKV-Genom (AM258994) über STAR (v2.5.2) im Basismodus mit zwei Durchgängen unter Verwendung der Gencode-Transkript-Annotation (vM25) enthielt. Strukturelle und nichtstrukturelle CHIKV-Polyproteinkoordinaten (CHIKVgp1 und CHIKVgp2) wurden zur Transkriptomanmerkung hinzugefügt, und die Transkriptanzahlmatrix wurde mithilfe der Funktion „Überlappungen zusammenfassen“ aus dem Paket „Genomic Alignments“ (v1.22.1) generiert. Die Analyse der differentiellen Genexpression basierend auf der negativen Binomialverteilung wurde mit DEseq2 (v1.26.0) durchgeführt. Für die Signalweganreicherungsanalyse wurden die Gene anhand der −Log10(FDR)-Werte eingestuft, wobei je nach Richtung der Änderung ein positiver oder negativer Wert zugewiesen wurde. Die Pfadlisten wurden aus dem Paket msigdbr (v7.2.1) (Hallmark, REACTOME oder KEGG) abgerufen und als Eingabe für die GSEA-Pfadanreicherungsanalyse über das R-Paket fgsea (v1.12.0) verwendet. Vulkandiagramme wurden mit ggplot2 (v3.3.3) und Heatmaps mit pheatmap (v1.0.12) erstellt.

Herzen wurden eingeschläferten Mäusen entnommen und in PFA, Lysin und Periodatpuffer (0,05 M Phosphatpuffer, 0,1 M L-Lysin, pH 7,4, 2 mg/ml NaIO4 und 10 mg/ml Paraformaldehyd) bei 4 °C für 24 Stunden fixiert . Anschließend wurden die Gewebe über Nacht bei 4 °C in 30 % Saccharose dehydriert und anschließend in OCT-Medien eingebettet. Gefrorene Gewebeschnitte wurden im NYU Experimental Pathology Research Laboratory mit einer Dicke von 5 μm geschnitten. Fc-Rezeptoren wurden mit 0,5 % Anti-CD16/32-Fc-Block-Antikörper (Biolegend, Klon 93), verdünnt in PBS, enthaltend 2 % Ziegenserum (Vector Laboratories, S-1000), 2 % FBS (Atlanta) und 0,25 % Triton-X, blockiert 100 (Fisher, BP151-100) für 1 Stunde bei RT. Die Schnitte wurden fünfmal mit demselben Puffer gewaschen und 1 Minute lang mit Trueblack Lipofuscin-Autofluoreszenzlöscher (Biotium, CAT23007) in 70 %igem Ethanol (5 % v/v) behandelt. Die Schnitte wurden fünfmal gewaschen und mit eF570-αSMA (Invitrogen, Klon: 1A4) mit entweder APC-CD45 (BioLegends, Klon: 30-F11), AF647-TNT (BD Pharmingen, Klon: 13-11) oder AF647-CD31 gefärbt (BioLegends, Klon: MEC13.3) oder AF647-Vimentin (Abcam, Klon: EPR3776) für 1 Stunde bei RT. Alle Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Für die IFITM3- oder ISG15-Färbung wurden die Objektträger 1 Stunde lang bei RT mit 1:100 Anti-Fragilis-Antikörper (Abcam, ab15592, polyklonal) oder 1:100 Anti-ISG15-Antikörper (Invitrogen, PA5-79523, polyklonal) gefärbt; gewaschen und 1 Stunde lang mit einem sekundären AF555-Anti-Kaninchen-Antikörper (Invitrogen) bei einer Verdünnung von 1:1000 gefärbt. Alle Objektträger wurden dann mit DAPI (Thermo) in einer Verdünnung von 1:1000 gefärbt. Die Schnitte wurden mit dem gleichen Puffer und der gleichen Halterung für die mikroskopische Analyse gewaschen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 880-Mikroskop (Carl Zeiss) aufgenommen.

Die Bilddaten wurden mit der Imaris-Softwareversion 9.8 (Bitplane; Oxford Instruments) verarbeitet und analysiert. Kurz gesagt wurden für jeden Kanal Oberflächen unter Verwendung eines bestimmten Schwellenwerts, einer Voxelanzahl und einer Oberflächenkorngröße erstellt. Die Auswahl der Parameter hing von jedem experimentellen Bildsatz ab. Nachdem die Parameter definiert waren, wurde eine Batch-Analyse durchgeführt, um die Gesamtmenge der überlappenden Oberflächen zwischen zwei Kanälen zu berechnen. Die Analyse wurde an 2 × 2-Kachelbildern durchgeführt, die mit 20-facher Vergrößerung mit dem konfokalen Zeiss 880-Mikroskop aufgenommen wurden, wobei 2–4 verschiedene Abschnitte pro Objektträger von zwei bis drei unabhängigen Tieren pro Bedingung abgebildet wurden.

Das Herz und ein Teil der aufsteigenden Brustaorta wurden eingeschläferten Mäusen entnommen, 72 Stunden lang in 10 % gepuffertem Formalin (Fisher Scientific) fixiert und in einem automatisierten Leica Peloris-Prozessor durch abgestuftes Ethanol, Xylol und Paraffin verarbeitet. In Paraffin eingebettete Fünf-Mikrometer-Schnitte wurden parallel zur Längsachse des Herzens aus zwei bis drei verschiedenen Ebenen (400 μm, 800 μm und 1200 μm; oder 800 μm und 1200 μm) geschnitten. Abschnitte des 4-Kammer-Herzens wurden entparaffiniert und mit Hämatoxylin und Eosin (Η&E) auf einem automatischen histochemischen Färbegerät Leica ST5020 oder auf einem automatischen Leica BondRX®-Färbegerät immungefärbt, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt: Schnitte für die Immunfärbung wurden einer Epitop-Entfernung für 20 Minuten bei 100 °C mit ER2-Lösung von Leica Biosystems (pH9, AR9640) unterzogen, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 22 °C mit entweder Anti-CD11b (Novus, NB110-89474), verdünnt 1 :10.000, mit Anti-CD3 (CST, 78588S; Klon E4T1B) oder mit Anti-gespaltenem CASP3 (CST, 9579S, Klon D3E9), verdünnt 1:1000. Die primären Antikörper wurden mit dem BOND Polymer Refine Detection System (Leica, DS9800) nachgewiesen. Als Positivkontrollen des IHC wurden Abschnitte der Milz von Mäusen mit Anti-CASP3 (ergänzende Abbildung 2b), Anti-CD3 und Anti-CD11b gefärbt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, entweder auf einem Leica AT2- oder Hamamatsu Nanozoomer HT-Ganzdiascanner gescannt und zur Ansicht und Kommentierung in die NYU Omero-Bilddatenbank importiert. Der Schweregrad der Gewebepathologie und die Bestimmung der verschiedenen in Tabelle S1 und S5 beschriebenen Kategorien wurden von einem Pathologen (NN) blind analysiert. Die Masson-Trichrom-Färbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt58. Kurz gesagt, entparaffinierte Objektträger wurden 1 Stunde lang bei 60 ° C in Bouin-Lösung fixiert. Die Objektträger wurden dann 10 Minuten lang seriell mit Weigert-Hämatoxylin (Polysciences, 25088B1&B2) gefärbt, gefolgt von 1 Minute lang mit Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin (Polysciences, 25088C) und 10 Minuten lang mit Phosphowolframsäure (Polysciences, 25088D), wobei zwischen jedem Schritt Waschvorgänge durchgeführt wurden. Die Objektträger wurden dann 5 Minuten lang direkt in Anilinblau (Polysciences, 25088E) überführt und 1 Minute lang in 1 % Essigsäure (Polysciences, 25088f) differenziert, bevor sie dehydriert und mit Permount (Fisher, SP15-100) fixiert wurden.

Um die Anzahl der gespaltenen CASP3+-Zellen zu bestimmen, wurden ganze Objektträgerscans mit der Bildanalysesoftware VisiopharmR, Version 2021.09, analysiert. Die Bilder wurden in die Datenbank von VisiopharmR importiert. Es wurde eine manuelle Darstellung der Regionen von Interesse (ROI) durchgeführt, um den Vierkammer-Herzabschnitt in rechte, linke Herzkammer, Septum und Vorhöfe zu unterteilen. Eine VisiopharmR-App wurde erstellt, um DAB-gefärbte Zellen im Mäuseherzen zu erkennen. Kurz gesagt wurden Bildvorverarbeitungsschritte durchgeführt, um Funktionen zu erstellen, die das DAB-Signal und das Kernsignal durch Farbentfaltung und Filterung verbessern. Die Segmentierung wurde mithilfe eines trainierbaren linearen Bayes'schen Algorithmus erreicht. Nachbearbeitungsschritte wurden angewendet, um Kerne als positiv oder negativ zu definieren. Für jede Analyse wurden positive und negative Kontrollen einbezogen. Die Ergebnisse wurden als Anzahl der gesamten Kerne, Anzahl der positiven und Anzahl der negativen Kerne pro analysiertem ROI bereitgestellt.

Mäuse wurden intravenös mit 1E5 PFU von CHIKV oder HI-Kontrolle infiziert und das Herz wurde bei 2 und 5 dpi gesammelt. Wie oben beschrieben erzeugte Herzgewebehomogenate wurden 1:5 in 5X PBS:HALT-Proteaseinhibitor EDTA-frei (Thermo) verdünnt. Die Gesamtproteinmenge wurde mithilfe des BCA-Proteinassays (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und die Proben wurden in PBS:HALT-Proteaseinhibitor auf 1,5 mg/ml verdünnt, 75-μl-Aliquots wurden hergestellt und bei –80 °C gelagert, bis sie benötigt wurden. Für das Serum wurde Blut wie oben beschrieben gesammelt, 30 Minuten bei RT inkubiert und 15 Minuten bei 4 ° C und 1000 × g zentrifugiert. Die obere Phase wurde dann in ein sauberes Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Proben wurden in ein sauberes Röhrchen überführt und dann 50-μl-Aliquots hergestellt und bei –80 °C gelagert, bis sie benötigt wurden. Herzhomogenate wurden mit einem Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex Assay Kit (Bio-Rad, Nr. m60009rdpd) auf Zytokin- und Chemokinspiegel analysiert. Herzhomogenate und Serum wurden mit ProcartaPlex Maus-IFN-α/IFN-β 2-plex (ThermoFisher, EPX02A-22187-901) auf IFN-I-Spiegel analysiert. Zytokine und Chemokine wurden auf einem MAGPIX-Gerät (Luminex) aufgezeichnet und durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert. Für die Datenerfassung und -analyse wurde die xPONENT-Software (Version 4.3.229.9) verwendet. Die für alle Analyten gemeldeten Werte lagen innerhalb der Nachweisgrenze der Methode und stellen die Ergebniswerte der Luminex-Quantifizierungen basierend auf den einzelnen Kalibrierungskurven für jeden Analyten dar.

Mäuse wurden intravenös mit 1E5 PFU von CHIKV oder HI-Kontrolle infiziert und Blut wurde wie oben beschrieben gesammelt, 30 Minuten bei RT inkubiert und 15 Minuten bei 4 ° C und 1000 × g zentrifugiert. Die obere Phase wurde dann in ein sauberes Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Proben wurden in ein sauberes Röhrchen überführt und dann 50-μl-Aliquots hergestellt und bei –80 °C gelagert, bis sie benötigt wurden. Das Serum wurde auf kardiales Troponin-T der Maus unter Verwendung einer vorbeschichteten Mikrotiterplatte (amsbio, AMS.E03T0017) und unter Verwendung einer rekombinanten kardialen Troponin-T-Standardkurve gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Daten von Tabula muris (Tabula Muris et al., 2018) wurden von https://tabula-muris.ds.czbiohub.org heruntergeladen. Die Daten wurden mit dem R-Paket Seurat (v3.2.1) analysiert. Kurz gesagt, die Daten wurden mithilfe der Funktion „Daten normalisieren“ mit Standardparametern normalisiert. Nach der Normalisierung haben wir die Funktion „Variable Merkmale suchen“ angewendet, um interessierende Gene zu identifizieren, die für die nachgelagerte Dimensionsreduktion über die Funktion „RunPCA“ und die Clusterbildung über die Funktionen „Nachbarn suchen“ und „Cluster suchen“ mit Standardparametern verwendet werden. Die ursprünglichen Clusteranmerkungen von Tabula Muris wurden beibehalten. Mit der Funktion „DotPlot“ wurde ein Punktdiagramm für die normalisierte Expression potenzieller Zellmarker erstellt.

Statistische Signifikanz wurde zugewiesen, wenn P-Werte <0,05 waren, unter Verwendung von Prism Version 9.5.1 (528) (GraphPad) oder R-Studio (v3.6.0). Spezifische Tests mit genauen P-Werten sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle Experimente wurden zumindest in biologischen Duplikaten durchgeführt.

In dieser Studie generierte Massen-RNA-Sequenzierungsdatensätze sind unter GEO: GSE204689 verfügbar. Mikroskopische Bilddaten werden in OMERO Plus v5.6 gespeichert und sind über den NYU-Datenkatalog zugänglich: https://datacatalog.med.nyu.edu/dataset/10621. Öffentliche Datensätze: Mausgenom (Version mm10, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/), CHIKV-Genom (AM258994, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 106880547). Öffentliche Datenbank: Tabula muris (https://tabula-muris.ds.czbiohub.org). Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert und/oder analysiert wurden, werden als Ergänzungstabelle beigefügt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code ist auf GitHub verfügbar: https://github.com/fizzo13/CHIKV.

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Wir möchten allen Mitgliedern des Stapleford-Labors für hilfreiche Kommentare zu diesem Manuskript danken. Wir danken dem NYUMC Experimental Pathology Research Laboratory, Mark Alu und Branka Brukner Dabovic. Wir danken auch dem NYU Genome Technology Center für die Unterstützung bei der Sequenzierung und dem NYU Langone Microscopy Laboratory für die Unterstützung bei der Bildgebung. Wir danken Dr. Meike Dittmann und Ken Cadwell, die freundlicherweise die notwendige Ausrüstung und Reagenzien zur Verfügung stellten. Wir danken Dr. Dominick Papandrea und Ludovic Desvignes für BSL3-Unterstützung. Wir danken Dr. Ken Cadwell und Victor Torres für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Startpaket der NYU Grossman School of Medicine (KAS), NIH/NIAID R01 AI162774-01A1 (KAS) und 1R01AI143861 (KMK) sowie den Pilotzuschuss des NYU Cardiocular Research Center Program (KAS und MGN) unterstützt. , Postdoktorandenstipendium der American Heart Association 19-A0-00-1003686 (MGN), Public Health Service Institutional Research Training Award T32 AI 7180-39 (BAR-R.), Training Program in Immunology and Inflammation Training Award 5-T32 AI100853- 10 (EB und PDY), der American Society of Hematology Fellow-to-Faculty Scholar Award ASH 204377-01 (FI), NIH 5F32 HL153598 (PDY). Das Experimental Pathology Research Laboratory (RRID:SCR_017928), das NYU Langone Microscopy Laboratory (RRID: SCR_017934) und der NYU Genome Technology Core (RRID: SCR_017929) werden teilweise durch den Förderzuschuss P30CA016087 des NYU Cancer Center sowie durch Laura und Isaac Perlmutter von NYU Langone unterstützt Krebszentrum. Das multispektrale Bildgebungssystem Akoya® wurde im Rahmen eines Shared Instrumentation Grant S10 OD021747 erworben.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Maria G. Noval, Kenneth A. Stapleford.

Abteilung für Mikrobiologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, USA

Maria G. Noval, Sophie N. Spector, Eric Bartnicki, Stephen T. Yeung, Payal Damani-Yokota, Bruno A. Rodriguez-Rodriguez, Kamal M. Khanna und Kenneth A. Stapleford

New York Genome Center, New York, NY, USA

Franco Izzo

Abteilung für Hämatologie und medizinische Onkologie, Abteilung für Medizin und Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Franco Izzo

Abteilung für Pathologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, USA

Navneet Narula, M. Zahidunnabi Dewan, Valeria Mezzano und Cynthia Loomis

Abteilung für fortgeschrittene Forschungstechnologien, Grossman School of Medicine der New York University, New York, NY, USA

Cynthia Loomis

Perlmutter Cancer Center, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, USA

Kamal M. Khanna

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MGN und KAS haben das Projekt konzipiert und Experimente konzipiert; MGN, SNS, EB, STY, PDY, BARR führten Experimente durch, FI analysierte RNA-seq-Daten; MGN, EB, FI und KAS analysierten die Daten, CL überwachte histologische Experimente, NN führte histopathologische Analysen durch; VM entwickelt die Visiopharm-App für die Histologieanalyse; MZD führte Kryoschnitte von Objektträgern durch; KK und KAS betreuten das Projekt. MGN und KAS haben den Originalentwurf verfasst, und alle Autoren waren an der Überprüfung und Bearbeitung des Manuskripts beteiligt.

Korrespondenz mit Maria G. Noval oder Kenneth A. Stapleford.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Noval, MG, Spector, SN, Bartnicki, E. et al. Die MAVS-Signalisierung ist erforderlich, um anhaltende Chikungunya-Herzinfektionen und chronische Gefäßgewebeentzündungen zu verhindern. Nat Commun 14, 4668 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40047-w

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Eingegangen: 07. April 2023

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40047-w

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